QuickMutation™基因隨機(jī)突變?cè)噭┖?/strong>
信裕生物生產(chǎn)的QuickMutation™基因隨機(jī)突變?cè)噭┖?QuickMutation™ Random Mutagenesis Kit)是一種基于易錯(cuò)PCR(Error Prone PCR)的方法使目的基因片段通過PCR擴(kuò)增后發(fā)生一定幾率的隨機(jī)突變的試劑盒。
基因的隨機(jī)突變是研究蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、以及抑制或者改良甚至創(chuàng)造蛋白或酶活性的重要方法。
易錯(cuò)PCR方法通常是指通過易錯(cuò)耐熱DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而在目的基因序列中引入隨機(jī)突變的方法。易錯(cuò)PCR方法在目的基因序列中引入隨機(jī)突變后，最終很可能在蛋白水平上產(chǎn)生氨基酸序列的突變，從而可以隨機(jī)產(chǎn)生活性更強(qiáng)、更弱甚至失去活性的蛋白或酶，也有可能使蛋白或酶產(chǎn)生新的活性。
為了分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，理想的突變應(yīng)該是每個(gè)蛋白發(fā)生1個(gè)氨基酸改變(1-2核苷酸突變)；在蛋白進(jìn)化研究方面，理想的突變是每個(gè)蛋白發(fā)生1-4個(gè)氨基酸改變(約2-7核苷酸突變)；從突變文庫(kù)中篩選高活性的蛋白或者酶則通常希望每個(gè)基因產(chǎn)生20個(gè)左右的核苷酸突變。
本試劑盒提供的RandomMut DNA polymerase，是一種全新的專門用于易錯(cuò)PCR的DNA聚合酶，在配套的反應(yīng)緩沖液中加入推薦量的Mutation enhancer情況下，可以在每kb的基因中引入約7.8個(gè)隨機(jī)突變，而且這些突變是AT→GC和GC→AT兩個(gè)方向的突變基本均衡的，(AT→GC mutations) / (GC→AT mutations) = 1.06，同時(shí)還會(huì)引入適量的插入(insertion)和缺失(deletion)突變。
本試劑盒擴(kuò)增出來的DNA片段為黏性末端，可以直接用于常規(guī)的T載體克隆。
本試劑盒可擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)6kb的目的片段。
用戶可以自行調(diào)整本試劑盒的突變幾率，使用更加便捷。本試劑盒提供了Mutation enhancer (10X)，通過改變Mutation enhancer的用量可以顯著影響突變率(參見表1)。
表1. 利用QuickMutation™基因隨機(jī)突變?cè)噭┖惺褂貌煌瑵舛鹊腗utation enhancer PCR擴(kuò)增1000bp片段后雙酶切插入空載體，然后隨機(jī)挑選若干克隆進(jìn)行測(cè)序分析的結(jié)果。PCR擴(kuò)增的1000bp模板片段插入在約4kb的質(zhì)粒中，測(cè)試時(shí)1000bp模板的用量是120pg/µl，相當(dāng)于模板質(zhì)粒的用量為600pg/µl，PCR循環(huán)數(shù)為30。
0.5X Mutation enhancer
1X Mutation enhancer
2X Mutation enhancer
Total mutations found
63
98
134
Mutations
Mutations
Percentage
Mutations
Percentage
Mutations
Percentage
A→T
8
12.7%
10
10.2%
21
15.7%
A→G
10
15.9%
13
13.3%
21
15.7%
T→A
7
11.1%
10
10.2%
15
11.2%
T→C
8
12.7%
15
15.3%
17
12.7%
G→A
11
17.5%
13
13.3%
10
7.5%
C→T
5
7.9%
10
10.2%
13
9.7%
Insertions
1
1.6%
1
1.0%
0
0.0%
Deletions
3
4.8%
4
4.1%
5
3.7%
Bias Indicators (AT→GC/GC→AT)
(AT→GC) / (GC→AT)
1.05
1.06
1.19
A→N, T→N
19+16=35
55.6%
25+29=54
55.1%
46+34=80
59.7%
G→N, C→N
14+10=24
38.1%
23+16=39
39.8%
24+25=49
36.6%
A→G, T→C
18
28.6%
28
28.6%
38
28.4%
G→A, C→T
16
25.4%
23
23.5%
23
17.2%
A→T, T→A
15
23.8%
20
20.4%
36
26.9%
A→C, T→G
2
3.2%
6
6.1%
6
4.5%
G→C, C→G
5
7.9%
7
7.1%
12
9.0%
G→T, C→A
3
4.8%
9
9.2%
14
10.4%
Insertions
1
1.6%
1
1.0%
0
0.0%
Deletions
3
4.8%
4
4.1%
5
3.7%
Mutations/kb (per PCR)
5.5
7.8
10.7
突變堿基數(shù)范圍
0-11
3-12
4-18
本試劑盒如果用于20µl的PCR突變體系，兩種包裝的本試劑盒分別可以進(jìn)行50次和200次基因隨機(jī)突變，如果用于50µl的PCR突變體系，兩種包裝的本試劑盒分別可以進(jìn)行20次和80次基因隨機(jī)突變。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
XY-0219S-1
RandomMut DNA polymerase
20µl
XY-0219S-2
RandomMut buffer (10X)
150µl
XY-0219S-3
Mutation enhancer (10X)
150µl
保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
PCR反應(yīng)非常靈敏，在使用RandomMut DNA polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量設(shè)置不加模板的空白對(duì)照。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 引物設(shè)計(jì)：
a. 引物的長(zhǎng)度通常為約20個(gè)堿基。
b. 如果引物帶有克隆酶切位點(diǎn)，引物長(zhǎng)度通常約為28-30個(gè)堿基，其中包含了酶切位點(diǎn)和通常必須添加的保護(hù)堿基以確保酶切效率。
c. 引物的GC含量盡量控制在40-60%。
d. 使用經(jīng)過PAGE純化的引物或更高純度的引物。
2. 隨機(jī)突變PCR反應(yīng)：
a. 參考下表設(shè)置隨機(jī)突變PCR反應(yīng)體系：
雙蒸水或MilliQ水
-
(13.2-x)μl
(33-y)μl
RandomMut buffer (10X)
1X
2μl
5μl
Mutation enhancer (10X)
1X
2ul
5ul
dNTP (2.5mM each)
0.25mM
2μl
5μl
模板DNA
0.2pg/μl -20ng/μl
xμl
yμl
引物混合物(10μM each)
0.2μM each
0.4μl
1μl
RandomMut DNA polymerase
-
0.4μl
1μl
b. 對(duì)于不同類型模板DNA的推薦用量如下：哺乳動(dòng)物基因組DNA 2-10ng/μl；大腸桿菌基因組DNA 0.2pg/μl-2ng/μl；質(zhì)粒DNA模板20pg/μl-5ng/μl，質(zhì)粒DNA模板的起始推薦用量為0.1-1ng/µl。隨機(jī)突變擴(kuò)增的模板DNA濃度越高，隨機(jī)突變率則越低。
c. 對(duì)于質(zhì)粒DNA模板的具體推薦用量請(qǐng)參考下表。低突變率(0-4.5 mutations/kb)，建議突變擴(kuò)增的模板DNA用量為1-20ng/μl；中突變率(4.5-9 mutations/kb), 建議突變擴(kuò)增的模板DNA為0.1-1ng/μl；高突變率(大于9 mutations/kb)，建議突變擴(kuò)增的模板DNA用量為2-100pg/μl。突變擴(kuò)增的模板DNA計(jì)算：上述推薦量是以擬PCR擴(kuò)增的目的片段的量(Target amount)進(jìn)行計(jì)算的，而不是以整個(gè)質(zhì)粒的量來計(jì)算，并且計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)是擬擴(kuò)增片段的大小為1kb。例如低突變率推薦的模板DNA用量為1-20ng/μl時(shí)，如果擬擴(kuò)增片段為1kb，質(zhì)?？偞笮?kb，實(shí)際的推薦質(zhì)粒用量為(1-20ng/μl)*(1kb/1kb)*(4kb/1kb)=4-80ng/μl；如果擬擴(kuò)增片段為2kb，質(zhì)?？偞笮?kb，實(shí)際的推薦質(zhì)粒用量為(1-20ng/μl)*(2kb/1kb)*(6kb/2kb)=6-120ng/μl。比較理想的模板用量需要根據(jù)實(shí)際突變效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
Mutation rate>
Mutations/kb
Target amount/20μl
Target concentration
Low
0-4.5
20-400ng
1-20ng/μl
Medium
4.5-9
2-20ng
0.1-1ng/μl
High
9-16
40pg-2ng
2-100pg/μl
d. 按照如下參數(shù)設(shè)置PCR儀：
步驟
循環(huán)數(shù)
溫度
擴(kuò)增時(shí)間
說明
(a) 上表中1min/kb表示，如果擴(kuò)增片段是2kb，那么72℃的延伸時(shí)間為2分鐘。
(b) 如果發(fā)現(xiàn)目的片段較難被擴(kuò)增，根據(jù)RandomMut DNA polymerase本身的特性，推薦嘗試使用92℃變性。
(c) PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的變性、退火和延伸的溫度和時(shí)間以及循環(huán)數(shù)等。
(d) 對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為30。
3. PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序：
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可以把PCR產(chǎn)物連入T載體，或者酶切后插入特定的目的載體，隨后即可轉(zhuǎn)化并挑取克隆進(jìn)行測(cè)序，以確認(rèn)隨機(jī)突變的效果。
常見問題：
1. PCR產(chǎn)物非常少：
a. 延伸時(shí)間是否足夠，可以將延伸時(shí)間調(diào)整為2min/kb。
b. 引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽(yáng)性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。待擴(kuò)增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。直接添加1-10% DMSO或5-20%甘油對(duì)于擴(kuò)增高GC含量的片段也有幫助。
c. PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
d. 由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火更加充分。
e. 退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
f. 延伸時(shí)間不足?？梢栽谕扑]的延伸時(shí)間基礎(chǔ)上把延伸時(shí)間延長(zhǎng)2-5倍，對(duì)于較難擴(kuò)增的片斷可以設(shè)置為每1kb延伸2分鐘。
g. 待擴(kuò)增片斷GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至94℃ 2-4min甚至94℃ 5min。
h. 在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
i. 循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
j. 模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
k. 對(duì)PCR引物進(jìn)行脫鹽純化。
l. 使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
m. 適當(dāng)增加DNA polymerase的用量。
n. 當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
o. 注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。
p. 使用完整、高純度、高質(zhì)量的DNA模板，且避免模板反復(fù)凍融。長(zhǎng)片段DNA反復(fù)凍融過程中可能會(huì)出現(xiàn)斷裂的問題。
q. Mg2+濃度較低，或Mg2+與dNTP的比例不合適。使用本產(chǎn)品中提供的緩沖液就無需擔(dān)心鎂離子濃度的問題。
r. 根據(jù)片段大小選擇合適的瓊脂糖凝膠濃度和電泳條件。大片段DNA的電泳需要使用低濃度的瓊脂糖凝膠和較低的電泳電壓，并電泳較長(zhǎng)的時(shí)間。
s. PCR反應(yīng)體系中有氣泡或者PCR管蓋子漏氣導(dǎo)致有溶液蒸發(fā)。
2. 雜帶較多或條帶彌散：
a. 退火溫度提高2-5℃。
b. 減少DNA模板的用量。
c. PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
d. 適當(dāng)減少DNA Polymerase的用量。
e. 適當(dāng)縮短延伸時(shí)間。
f. 減少循環(huán)數(shù)可減少非特異性條帶的產(chǎn)生。
3. 隨機(jī)突變率結(jié)果不理想：
a. 突變率偏低。
(a) 可適當(dāng)提高M(jìn)utation enhancer (10X)的使用量至使用標(biāo)準(zhǔn)推薦用量1.2、1.5甚至2倍的用量(參考表1)。注意：隨著Mutation enhancer (10X)的用量增多，AT→GC/GC→AT的比值會(huì)越高，即AT變成GC的傾向越高。
(b) 可采用連續(xù)易錯(cuò)PCR策略：即將一次易錯(cuò)PCR擴(kuò)增得到的突變幾率較低的產(chǎn)物作為下一次待擴(kuò)增的模板，連續(xù)兩次甚至多次進(jìn)行易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變，使每一次擴(kuò)增獲得更多的突變，并且也可以通過這種方法累積有益突變。
(c) 減少突變擴(kuò)增的模板DNA用量，并增加擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，減少模板用量并增加擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)會(huì)提高突變幾率。擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)最多可以增加到35-40個(gè)循環(huán)。
b. 突變率偏高。
(a) 可適當(dāng)減少M(fèi)utation enhancer (10X)的使用量至使用標(biāo)準(zhǔn)推薦用量0.8或0.5倍的用量。
(b) 可通過提高突變擴(kuò)增的模板DNA用量(500-1000ng)來減少突變率。
(c) 減少PCR循環(huán)數(shù)至20~25個(gè)循環(huán)。
關(guān)鍵字： QuickMutation?基因隨機(jī)突變?cè)噭┖姓f明書；QuickMutation?基因隨機(jī)突變?cè)噭┖袕S家
上?？道噬锟萍加邢薰臼且患壹邪l(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè)，專營(yíng)生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等高生物產(chǎn)品?？偛课挥谏虾?，并在北京、廣東，江西，吉林等全國(guó)30多個(gè)省市設(shè)有分公司和代理機(jī)構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國(guó)科學(xué)院、清華、北大、復(fù)旦，上海交大，復(fù)旦醫(yī)學(xué)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，華東師范大學(xué)，第二軍醫(yī)大學(xué)，曙光醫(yī)院，浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用，可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。