T3 RNA Polymerase

T3 RNA Polymerase，即T3 RNA聚合酶，是一種高度特異識(shí)別T3啟動(dòng)子序列的DNA依賴(lài)的5'→3'RNA聚合酶。T3 RNA 
Polymerase可以催化單鏈或雙鏈DNA T3啟動(dòng)子下游NTP的摻入，合成與T3啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA。
特點(diǎn)：T3 RNA Polymerase可以識(shí)別修飾的NTP，例如生物素標(biāo)記、熒光素標(biāo)記的NTP，可以用于各種標(biāo)記RNA的合成。同時(shí)對(duì)于T3啟動(dòng)子有高度的特異性。
用途：用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：雜交探針，基因組DNA序列分析，核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定(RNase 
protection assay)，反義RNA合成，作為體外翻譯的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和RNA-蛋白質(zhì)相互作用，核酸擴(kuò)增分析，siRNA、miRNA等小RNA。
來(lái)源：由大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)基因?yàn)槭染wT3 RNA Polymerase基因。
活性定義： 37℃60分鐘內(nèi)，催化1nmol AMP摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定義為1個(gè)活性單位。
活性檢測(cè)條件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl₂，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，
0.6MBq/ml[³H]-ATP，20μg/ml plasmid DNA containing the specific T3 RNA Polymerase promoter sequence。
純度：不含DNA內(nèi)切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶儲(chǔ)存溶液：50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，5mM DTT，0.1mg/ml BSA，0.5mM Elugent，50% glycerol。
Transcription Buffer(5X)：200mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，30mM MgCl₂，50mM DTT，50mM NaCl，10mM 
spermidine。
失活或抑制：70℃加熱10分鐘可使T3 RNA Polymerase失活。加入適量EDTA也可以使T3 RNA Polymerase失活。螯合劑、濃度大于150mM的鈉、鉀或銨鹽可以顯著抑制T3 RNA Polymerase的活性。
T3的consensus promotersequence如下：
-15  -10   -5   +1  +5
AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)： 
酶使用時(shí)宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后宜立即放置于-20℃保存。
本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1. RNA合成：
a. DNA模板經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切線(xiàn)性化。
b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于適量的無(wú)菌去離子水中。本步驟也可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒，例如信裕生物的
DNA純化試劑盒(D0033)，直接進(jìn)行純化，從而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀這些步驟。
c. 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)體系：

d. 按上表設(shè)置好反應(yīng)體系后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
e. 37℃孵育1～2個(gè)小時(shí)。
f. 加入2μl 0.5M EDTA (pH 8.0)到反應(yīng)體系中混勻或-20℃冷卻終止反應(yīng)。
g. 電泳分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或通過(guò)其他適當(dāng)方法鑒定轉(zhuǎn)錄的效率。
注意： 
a) 轉(zhuǎn)錄需在無(wú)RNA酶條件下進(jìn)行。
b) 反應(yīng)體系需在室溫條件下配置，4℃有亞精胺(spermidine)存在時(shí)DNA可發(fā)生沉淀。
c) 按以上反應(yīng)條件，每1μg 模板DNA可合成超過(guò)10μg 的RNA。
d) 如果模板DNA的線(xiàn)形化不太完全，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出比預(yù)期長(zhǎng)度更長(zhǎng)的RNA，同時(shí)使預(yù)期長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄本比例下降。
e) 可根據(jù)實(shí)際情況按照比例放大或縮小上述反應(yīng)體系。
2. 放射標(biāo)記RNA的合成：
a. DNA模板經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切線(xiàn)性化。
b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于適量的無(wú)菌去離子水中。本步驟也可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒，例如信裕生物的
DNA純化試劑盒(D0033)，直接進(jìn)行純化，從而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀這些步驟。
c. 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)體系：

d. 37℃孵育1～2個(gè)小時(shí)。
e. -20℃冷卻終止反應(yīng)。
f. 分析和檢測(cè)RNA的標(biāo)記效率。
注意： 
a) 按以上方法合成的RNA活性一般為3-5 x10⁸dpm/μg。
b) 上述標(biāo)記反應(yīng)中也可以使用[³²P]、[³⁵S]或[³H]標(biāo)記的其他NTP。使用其他放射性標(biāo)記的NTP時(shí)，其他的NTP需作相應(yīng)調(diào)整。20μl反應(yīng)體系各成分推薦使用劑量分別為：1.85MBq(50μCi)5'-[α-³²P]-CTP,～30TBq/mmol(800Ci/mmol)；11.1MBq(300μCi)5'-[α-³⁵S]-UTP,>37TBq/mmol(>1000Ci/mmol)；0.925MBq(25μCi)5,6-[³H]-UTP,1.1-2.2TBq/mmol(30-60Ci/mmol)。
c) 放射性標(biāo)記NTP濃度低于12μM時(shí)，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本合成效率也會(huì)下降。
3. 其它用途可以參考上述用途或相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行。