檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說明書
分光光度法 25管/12樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒測(cè)定意義：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。
測(cè)定原理：
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體25mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：液體5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體0.5mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體28mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入1.2mL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。
⑤ 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CS測(cè)定。
檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）在試劑五中加入0.6mL無水乙醇和13mL試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）測(cè)定管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑五和40μL試劑六，混勻，37℃反應(yīng)15min后立即測(cè)定吸光值A1。
（3）對(duì)照管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑四和40μL試劑六，混勻，37℃反應(yīng)15min后立即測(cè)定吸光值A2。
（4）計(jì)算ΔA=A1-A2，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
CS活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=23.8×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.0475×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，9.6×10-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
關(guān)鍵字： 檸檬酸合酶（citrate syntha;檸檬酸合酶（citrate syntha;
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