氨甲酰化是一種非酶促且不可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，其中氰酸/異氰酸向賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基添加一個(gè)羰基團(tuán)，將賴氨酸轉(zhuǎn)化為非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸同型瓜氨酸。氰酸主要由尿素分解形成，也可以在髓過(guò)氧化物酶的作用下，通過(guò)硫氰酸鹽的氧化在炎癥部位形成，例如動(dòng)脈粥樣硬化組織。低密度脂蛋白(LDL)可以發(fā)生羰基化，具有動(dòng)脈粥樣硬化性質(zhì)，破壞LDL受體結(jié)合，增加血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞死亡。患有導(dǎo)致尿素水平升高的疾?。ㄈ缏院徒K末期腎臟疾?。┑幕颊哐獫{中的蛋白質(zhì)羰基化和羰基化LDL水平增加。此外，血漿中與蛋白質(zhì)結(jié)合的同型瓜氨酸水平與主要不良心臟事件的頻率和死亡率呈正相關(guān)，并可預(yù)測(cè)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。羰基化蛋白還可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致抗同型瓜氨酸自身抗體的產(chǎn)生，這些抗體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中水平較高，并與關(guān)節(jié)損傷程度呈正相關(guān)。

艾美捷氨基甲酸酯化IP試劑盒（#601930-1）提供了一種方便的方法，用于從細(xì)胞裂解液中捕獲和濃縮羰基化蛋白，該方法是使用與瓊脂糖珠偶聯(lián)的抗羰基化單克隆抗體。從樹(shù)脂中洗脫捕獲的蛋白后，可以通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離，并通過(guò)西方印跡(WB)分析，使用試劑盒中包含的抗羰基化(同型瓜氨酸)多克隆抗體或用戶提供的特定目標(biāo)抗體。試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照樣本確保了檢測(cè)的適當(dāng)性能:

1. 確定處理樣本與未處理樣本中賴氨酸羰基化的變化。

2. 證明目標(biāo)蛋白在體外發(fā)生了羰基化。

3. 通過(guò)西方印跡和蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定和表征羰基化蛋白。

檢測(cè)前準(zhǔn)備

試劑準(zhǔn)備:

除非另有說(shuō)明，所有試劑都可以直接使用。裂解緩沖液

·檢測(cè)與廣泛的裂解緩沖液兼容

·避免使用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的緩沖液成分

·盡可能減少還原劑（例如，DTT）和洗滌劑的使用

·建議的裂解緩沖液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5，含有150 mM NaCl，0.5%（體積/體積）NP-40，以及蛋白酶抑制劑混合物。

洗脫試劑:

選擇適合預(yù)期分析方法的適當(dāng)洗脫試劑：

a) SDS-PAGE樣品加載緩沖液，用于WB分析

b) 0.1%甲酸，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析

樣品準(zhǔn)備:

推薦的樣品/對(duì)照裂解液的體積和濃度為200μl，濃度為1-5 mg/ml，作為一個(gè)起點(diǎn)。如有必要，用裂解緩沖液調(diào)整裂解液濃度。建議使用500 ng羰基化牛血清白蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。

執(zhí)行檢測(cè)

檢測(cè)優(yōu)化:

從特定裂解液樣本中捕獲羰基化蛋白的最佳檢測(cè)條件必須由用戶確定。調(diào)整以下參數(shù)可能有助于此過(guò)程：

- 樣本體積：100-500μl

- 樣本濃度：1-5mg/ml

- 羰基化親和吸附劑體積：40μl懸浮液（20μl沉降樹(shù)脂）

- 檢測(cè)時(shí)間：最少1小時(shí)至過(guò)夜

在整個(gè)設(shè)置過(guò)程中，保持反應(yīng)組分在冰上。

羰基化親和吸附劑準(zhǔn)備:

1. 通過(guò)輕輕倒置管子，重新懸浮羰基化親和吸附劑（項(xiàng)目編號(hào)601931）。

2. 將40μl的羰基化親和吸附劑懸浮液（20μl沉降樹(shù)脂）分裝到所需數(shù)量的微量離心管中。

3. 每個(gè)管子加入1ml洗滌緩沖液。

a. 使用移液器混合。

b. 以低速（500-1,000xg，兩分鐘）離心以收集基質(zhì)。

c. 丟棄流穿液。

4. 至少重復(fù)基質(zhì)洗滌/收集步驟兩次。

5. 向管中加入200μl樣本裂解液或500 ng羰基化牛血清白蛋白對(duì)照。

6. 在4℃下旋轉(zhuǎn)混合孵育1小時(shí)。

7. 以低速（500-1,000×g，兩分鐘）離心以收集基質(zhì)。

8. 移除流穿液并保留為“未結(jié)合部分”，以備后續(xù)分析（如需要）。

9. 將柱子放回收集管中。

10. 通過(guò)向管中加入1ml洗滌緩沖液來(lái)洗滌基質(zhì)。

· 以低速（500-1,000×g，兩分鐘）離心以收集基質(zhì)。

· 再重復(fù)洗滌步驟三次。

11. 對(duì)于SDS-PAGE/WB分析：

· 在最后一次洗滌后盡可能移除流穿液，但不要移除樹(shù)脂。

· 向管中加入20μl的1X SDS-PAGE樣品緩沖液并用手指輕彈混合。

· 加熱至75℃，持續(xù)10分鐘。

· 以低速（500-1,000×g，兩分鐘）離心以收集洗脫物。

12. 對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)分析：

· 在最后一次洗滌后盡可能移除流穿液，但不要移除樹(shù)脂。

· 向樹(shù)脂中加入10倍體積（200μl）的0.1%甲酸。

· 在室溫下旋轉(zhuǎn)混合5-10分鐘。

· 以低速（500-1,000xg，兩分鐘）離心以收集洗脫物。

· 將洗脫液冷凍干燥并在后續(xù)處理分析前重新懸浮于胰蛋白酶消化或其他緩沖液中，或存儲(chǔ)于-20℃。

化驗(yàn)結(jié)果示例:

圖.氨甲?；疘P試劑盒的蛋白質(zhì)印跡分析。使用甲酰化親和吸附劑將甲?；蛯?duì)照細(xì)胞裂解物以及提供的陽(yáng)性對(duì)照物拉下，洗脫，在12%凝膠上運(yùn)行，轉(zhuǎn)移硝化纖維素，并用提供的抗甲?；ǜ吖习彼幔┒嗫寺】贵w進(jìn)行檢測(cè)。這些數(shù)據(jù)表明，親和吸附蛋白和多克隆抗體都只識(shí)別氨基甲?；鞍住?/p>

https://www.amyjet.com/products/601930-1.shtml