近期，我司收到客戶反饋：采用歐洲藥典(EP)方法做有關(guān)物質(zhì)分析時，雜質(zhì)B(Amlodipine EP Impurity B; CAS No: 721958-72-1)與雜質(zhì)G(Amlodipine EP Impurity G; CAS No:43067-01-2)的液相色譜(HPLC)出峰順序與預(yù)期不符。對此，我中心高度重視并立即啟動調(diào)查，旨在確保產(chǎn)品質(zhì)量可控、分析方法可靠。
一、研發(fā)背景：售后反饋遇難題
客戶反饋：氨氯地平EP雜質(zhì)B、G相對保留時間對不上標準，客戶具體檢測數(shù)據(jù)：客戶采用了GL sciences的ODS-3色譜柱(5um)以及Agilent色譜柱(Pursuit XRs)，出峰差不多，RRT都與標準不符，具體見圖1和圖2：
圖1：客戶提供的雜質(zhì)混樣圖
圖2：客戶提供的雜質(zhì)混樣RRT數(shù)據(jù)與EP藥典標準收錄信息
從圖1和圖2兩張圖就可以看出，雜質(zhì)B、G與客戶標準收錄的RRT有很大的差異，API出峰：4.152min；雜質(zhì)B出峰10.629；RRT=2.56（客戶標準收錄0.25,與EP標準一致）；EP雜質(zhì)G出峰6.458,RRT=1.56（客戶標準收錄0.21，與EP標準一致），因此客戶給我們反饋售后認為我們產(chǎn)品不對。這個售后讓我們感到非常疑惑，該系列雜質(zhì)已經(jīng)銷售了十多年了，理論上不會出現(xiàn)售后情況，而且復(fù)盤了對應(yīng)批次產(chǎn)品已經(jīng)交付了十幾家客戶，別的客戶都未有反饋類似的售后，所以我中心決定從兩個方向去找尋問題的真相。
氨氯地平以及氨氯地平EP雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式信息如圖3：
圖3：氨氯地平及EP雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式信息
二、初步研究與結(jié)論
1.雜質(zhì)定性驗證
首先對雜質(zhì)B、G的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行復(fù)核，根據(jù)質(zhì)譜(MS)+核磁共振(NMR)分析，確認產(chǎn)品中以上兩個雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)無誤，排除了化合物本身的定性問題（PS：為了準確的驗證產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，我中心還做了兩個雜質(zhì)的二維核磁譜，由于該產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)簡單，一維數(shù)據(jù)就能較好的證明產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，故未放上B、G二維核磁數(shù)據(jù)，有需要的客戶可以私下聯(lián)系業(yè)務(wù)員索取）。
圖4：氨氯地平EP雜質(zhì)B(RM-A131202)和雜質(zhì)G(RM-A131207)的質(zhì)譜圖
圖5：氨氯地平EP雜質(zhì)B(RM-A131202)和雜質(zhì)G(RM-A131207)的HNMR信息和歸屬
2.色譜條件的排查
從圖1和圖2可以明顯看到客戶的方法是在EP方法上做了一些調(diào)整的（EP的aldp的RT是20min），但是跟客戶溝通之后反饋除了換了色譜柱，其他跟EP方法都是一致的，故我們懷疑數(shù)據(jù)異常大概率是色譜柱的原因引起。隨后，我們嚴格按照EP方法參數(shù)（流動相組成、梯度程序、柱溫等）復(fù)測了雜質(zhì)B,D,E,F和G，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)的保留時間確實存在交叉現(xiàn)象。進一步擴大實驗范圍，選擇5種不同品牌C18色譜柱（品牌YMC-Pack ODS 150*4.6 mm,Waters Xbridge 250*4.6 mm,技爾 ODS-4 150*4.6 mm,Welch Xtimate-C18 250*4.6 mm,Zorbax SB-C18 250*4.6 mm）進行對比，結(jié)果顯示：不同色譜柱的雜質(zhì)出峰順序存在顯著差異（如圖6所示）。
圖6：不同色譜柱中B、D、E、F、G雜質(zhì)的液相出峰情況
三、關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：色譜柱選擇性差異
C18色譜柱的性能受多種因素影響，包括硅膠純度、鍵合相密度、封端工藝、孔徑大小等。氨氯地平雜質(zhì)B與G為結(jié)構(gòu)類似物（均為二氫吡啶類衍生物），其分離高度依賴于色譜柱的選擇性。
疏水性與立體選擇性差異：不同品牌色譜柱的鍵合相覆蓋率或空間構(gòu)型可能改變雜質(zhì)分子與固定相的相互作用，導(dǎo)致保留行為偏移。
方法專屬性的局限性：EP方法基于特定色譜柱開發(fā)，其選擇性可能無法完全轉(zhuǎn)移至其他品牌色譜柱。
四、小結(jié)
通過我們的驗證數(shù)據(jù)，我們給客戶做了一個反饋，數(shù)據(jù)異常核心在色譜柱，客戶后來嚴格按照標準中收錄的色譜柱(Waters Spherisorb ODS1, 250x4.6mm，5μm)進行檢測，數(shù)據(jù)就能與標準對得上，該售后得到圓滿的解決。
針對氨氯地平產(chǎn)品檢測的解決方案與建議：
1. 嚴格遵循EP推薦色譜柱
實驗證實，未使用EP指定品牌色譜柱時，雜質(zhì)B與G的出峰順序與藥典不一致。建議客戶在檢測中優(yōu)先采用EP推薦色譜柱，以確保結(jié)果的可比性與合規(guī)性。
2. 方法轉(zhuǎn)移時的系統(tǒng)適用性驗證
若需更換色譜柱，必須重新進行系統(tǒng)適用性測試(SST)，重點關(guān)注:雜質(zhì)B與G的分離度（需滿足EP要求）和 出峰順序與保留時間的匹配性。
3. 技術(shù)溝通與支持
針對客戶疑問，我司可提供雜質(zhì)對照品與EP色譜柱信息，協(xié)助優(yōu)化分離條件，確保檢測結(jié)果準確可靠。
五、總結(jié)
氨氯地平雜質(zhì)檢測的出峰順序問題，本質(zhì)是色譜柱選擇性的差異所致。藥典方法開發(fā)時已針對特定色譜柱優(yōu)化選擇性參數(shù)，因此嚴格遵循藥典推薦條件對方法重現(xiàn)性至關(guān)重要。我們建議用戶在選擇替代色譜柱時，充分評估分離性能，必要時聯(lián)系我司技術(shù)支持團隊。
