近年來，隨著全球?qū)ι镏扑幒途珳?zhǔn)醫(yī)療需求的持續(xù)增長，對高效、特異性蛋白酶的需求也在不斷攀升。國內(nèi)企業(yè)在研發(fā)和生產(chǎn)方面的實(shí)力逐漸增強(qiáng)，尤其在Kex2蛋白酶的生產(chǎn)技術(shù)、純度提升和應(yīng)用開發(fā)等方面取得了顯著進(jìn)展。Kex2蛋白酶（E.C.3.4.21.61）憑借其卓越的特異性和高效性，在生物制藥、蛋白質(zhì)研究和工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的重要性日益凸顯，成為眾多生物技術(shù)企業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。

* 重組雙堿性氨基酸內(nèi)肽酶（重組Kex2蛋白酶）的結(jié)構(gòu)分析

Kex2蛋白酶（E.C.3.4.21.61）屬于枯草桿菌蛋白酶家族，為酵母自身編碼的一種前體加工酶，分為Kex2蛋白酶和重組Kex2蛋白酶兩大類。天然存在的Kex2蛋白酶，主要是通過傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中提取和純化，生產(chǎn)過程較為復(fù)雜，產(chǎn)量相對較低，可能會含有少量的宿主蛋白和其他雜質(zhì)。

冀百康生物重組Kex2蛋白酶采用重組畢赤酵母（Pichia pastoris）高效分泌表達(dá)技術(shù)，經(jīng)分離純化得到，適合進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，活性更高，純度更高，宿主蛋白殘留少，質(zhì)量更加穩(wěn)定。

 識別與結(jié)合

· 特異性識別位點(diǎn)：能夠專一性地識別和切割 Lys-Arg，Arg-Arg，Pro-Arg 等雙堿性氨基酸的羧基端肽鍵。這種特異性識別是通過其獨(dú)特的活性中心實(shí)現(xiàn)的，該活性中心能夠精確地識別并結(jié)合到目標(biāo)肽段的特定序列上。

· 底物結(jié)合：酶的活性位點(diǎn)與底物的雙堿性氨基酸殘基對結(jié)合，形成酶-底物復(fù)合物.這種結(jié)合是通過氫鍵、疏水作用和離子鍵等多種相互作用力共同作用的結(jié)果。

 Ca²⁺依賴性

· 重組Kex2蛋白酶的活性依賴于Ca²⁺的存在。Ca²⁺在酶的活性中心中起到穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)和促進(jìn)催化反應(yīng)的作用。這種依賴性使得重組Kex2蛋白酶酶在沒有Ca²⁺的環(huán)境中活性大大降低，從而在實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用中需要添加Ca²⁺以維持其活性。

 催化過程

· 催化三聯(lián)體：重組Kex2蛋白酶的催化機(jī)制依賴于其絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體，即絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）這三個(gè)氨基酸殘基協(xié)同作用，形成一個(gè)有效的催化中心。

· 質(zhì)子轉(zhuǎn)移：組氨酸在反應(yīng)中起到質(zhì)子轉(zhuǎn)移的作用，幫助穩(wěn)定過渡態(tài)并促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。

· 水解反應(yīng)：隨后，水分子進(jìn)入活性中心，與?；?酶中間體發(fā)生水解反應(yīng)，最終釋放出切割后的肽段。

切割特性

· 切割位點(diǎn)：重組Kex2蛋白酶特異性切割雙堿性氨基酸殘基對的羧基端肽鍵。例如，在Arg-Arg序列中，切割發(fā)生在第二個(gè)Arg的羧基端，從而將蛋白質(zhì)前體切割成成熟的蛋白質(zhì).

· 非特異性切割的避免：與胰蛋白酶不同，Kex2蛋白酶不能識別和切割單一堿性氨基酸（如Arg或Lys）的羧基端肽鍵。這種特異性避免了不必要的非特異性切割，提高了切割的準(zhǔn)確性.

* Kex2切割點(diǎn)位

（來源：Improving the Secretory Expression of an -Galactosidase from Aspergillus niger in Pichia pastoris - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/a-The-Kex2-signal-peptide-cleavage-site-The-extracellular-b-and-intracellular-c_fig5_306394202 [accessed 6 Jan 2025]）

? 高特異性 

能夠?qū)Ｒ恍缘刈R別和切割 Lys-Arg，Arg-Arg，Pro-Arg 等雙堿性氨基酸的羧基端肽鍵，避免非特異性切割。

? 高純度和活性 

重組Kex2蛋白酶通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)，具有更高的純度和活性，避免了天然Kex2蛋白酶來源有限和純度不高的缺點(diǎn)。

? 穩(wěn)定性強(qiáng) 

在偏酸性環(huán)境中（pH 5.0-6.0）穩(wěn)定，且不受常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑（如PMSF、TPCK）的抑制。

? 無動物源性 

重組Kex2蛋白酶采用重組畢赤酵母高效分泌表達(dá)技術(shù)的生產(chǎn)，過程中不使用動物來源的原料，避免了動物病毒和外源因子的污染。

產(chǎn)品參數(shù)

* 實(shí)際參數(shù)以產(chǎn)品每批次COA為準(zhǔn)；

生物制藥

胰島素類似物生產(chǎn)：重組Kex2蛋白酶在重組胰島素及其類似物（如門冬胰島素、地特胰島素、谷胰島素）的生產(chǎn)中用于前體蛋白的酶切加工。

多肽藥物生產(chǎn)：在GLP-1類似物及其他多肽藥物的生產(chǎn)過程中，重組Kex2蛋白酶用于工藝酶切或轉(zhuǎn)肽。

外源蛋白表達(dá)：在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，設(shè)計(jì)蛋白序列時(shí)引入重組Kex2蛋白酶切位點(diǎn)，使在后期的分泌表達(dá)過程中被酵母自身重組Kex2蛋白酶識別而酶切，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的大量表達(dá)。

蛋白質(zhì)研究

酶解和肽圖分析：重組Kex2蛋白酶用于蛋白質(zhì)的酶解和肽圖分析，幫助研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。

蛋白質(zhì)測序：在蛋白質(zhì)測序過程中，重組Kex2蛋白酶可用于切割蛋白質(zhì)，生成適合測序的肽段。

生物技術(shù)

酵母表達(dá)系統(tǒng)：在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，重組Kex2蛋白酶用于外源蛋白的前體加工，確保目標(biāo)蛋白的正確折疊和分泌。

基因工程：在基因工程研究中，重組Kex2蛋白酶可用于切割特定的蛋白質(zhì)片段，以便進(jìn)行進(jìn)一步的基因克隆和表達(dá)。

其他應(yīng)用

食品工業(yè)：在食品加工過程中，重組Kex2蛋白酶可以用于蛋白質(zhì)的改性，改善食品的口感和營養(yǎng)價(jià)值。

化妝品行業(yè)：用于化妝品中蛋白質(zhì)的加工和改性，以提高產(chǎn)品的功效。

重組Kex2蛋白酶作為一種高純度、高活性、特異性強(qiáng)的酶，憑借其在生物制藥、蛋白質(zhì)研究和工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)不可或缺的重要工具。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和市場需求的持續(xù)增長，重組Kex2蛋白酶的應(yīng)用前景將更加廣闊。未來，冀百康生物將繼續(xù)加強(qiáng)重組Kex2蛋白酶在研發(fā)和生產(chǎn)方面的技術(shù)創(chuàng)新和質(zhì)量控制，以提升產(chǎn)品競爭力，滿足不斷增長的市場需求。

* 本品僅用于科研生產(chǎn)應(yīng)用，不得用于人體。

參考文獻(xiàn)：

1、王彤, 徐巖, 喻曉蔚. 畢赤酵母Kex2蛋白酶的同源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì) *[J]. 中國生物工程雜志, 2019, 39(1): 38-45 https://doi.org/10.13523/j.cb.20190105

2、Improving the Secretory Expression of an -Galactosidase from Aspergillus niger in Pichia pastoris - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/a-The-Kex2-signal-peptide-cleavage-site-The-extracellular-b-and-intracellular-c_fig5_306394202 [accessed 6 Jan 2025]