目標(biāo)物種（一抗）
在選擇用于蛋白質(zhì)印跡的二抗時(shí)，主要選擇標(biāo)準(zhǔn)之一是二抗所結(jié)合的一抗的物種。例如，如果一抗是兔多克隆IgG，則可以使用在另一個(gè)宿主物種（例如山羊、驢或小鼠）中產(chǎn)生的抗兔IgG二抗來(lái)檢測(cè)一抗（例如，山羊抗兔IgG二抗Ab176443）。
為了通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)多個(gè)特定蛋白質(zhì)靶標(biāo)，使用來(lái)自不同物種的一抗會(huì)很有幫助。然后可以使用標(biāo)記有不同熒光染料（例如 Alexa Fluor Plus 488、555、647或680）的匹配二抗進(jìn)行多重?zé)晒獾鞍踪|(zhì)印跡。
我們提供多種標(biāo)記二抗，適用于熒光或化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡。從超過(guò)15種目標(biāo)物種中選擇，找到與您的一抗相匹配的新二抗。
我們可以生成二抗以結(jié)合整個(gè)一抗免疫球蛋白，例如H+L（重鏈和輕鏈）靶向二抗，或者可以生成二抗以僅結(jié)合免疫球蛋白的特定部分，例如kappa與lambda 輕鏈特異性二抗、重鏈與輕鏈特異性二抗或片段特異性二抗。例如Fc片段特異性二抗、F(ab) 或 F(ab')2 特異性二抗。
在規(guī)劃蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，除了優(yōu)化抗體稀釋度等其他因素外，二抗的選擇也有助于獲得最佳結(jié)果。精心選擇二抗并優(yōu)化稀釋度可以顯著改善蛋白質(zhì)印跡分析，尤其是在處理同一蛋白質(zhì)印跡膜上不同豐度的蛋白質(zhì)靶標(biāo)或高親和力與低親和力的一抗時(shí)。
靶標(biāo)豐度變化非常常見(jiàn)，因?yàn)樯蠘訉?duì)照管家蛋白在裂解物中非常豐富，而許多目標(biāo)蛋白靶標(biāo)可能僅以低拷貝數(shù)表達(dá)。在同一膜上同時(shí)可視化兩者可能具有挑戰(zhàn)性。下表提供了一般準(zhǔn)則，可幫助利用不同二抗的獨(dú)特功能來(lái)改善蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。
H+L鏈特異性：多種二抗與一抗的重鏈和所有免疫球蛋白的輕鏈結(jié)合
優(yōu)點(diǎn)：
（1）最通用的選擇。抗體可與重鏈和輕鏈結(jié)合，而不受一抗結(jié)構(gòu)影響。
（2）推薦用于化學(xué)發(fā)光和熒光蛋白質(zhì)印跡法中蛋白質(zhì)靶標(biāo)的高信號(hào)放大。
（3）利用交叉吸附或高度交叉吸附的抗體獲得高靈敏度和低背景。
缺點(diǎn)：
（1）高豐度靶標(biāo)檢測(cè)可能導(dǎo)致高抗體濃度下線性檢測(cè)范圍之外的信號(hào)飽和。
（2）建議使用交叉吸附或高度交叉吸附的H+L二抗，以最大限度地減少與樣品中IgG結(jié)合蛋白的交叉反應(yīng)。
（3）可能與其他免疫球蛋白的輕鏈發(fā)生交叉反應(yīng)。例如，所有山羊抗兔 IgG（H+L）二抗不僅會(huì)與兔IgG重鏈（γ鏈）結(jié)合，還會(huì)與所有兔免疫球蛋白（如IgM、IgE 或IgA）的輕鏈結(jié)合。
Fc片段特異性：二抗與重鏈的 Fc 部分結(jié)合
優(yōu)點(diǎn)：
（1）是檢測(cè)小鼠單克隆一抗的良好選擇，結(jié)合不依賴于輕鏈特異性。
（2）當(dāng)一抗靶標(biāo)在~25 kD處時(shí)，可在免疫沉淀后用于結(jié)合天然一抗IgG。Fc特異性二抗僅檢測(cè)變性IgG的50 kD重鏈，而不結(jié)合25 kD輕鏈。
（3）可用于檢測(cè)重鏈Fc部分不同的特定免疫球蛋白同型和亞類。此特性使得使用不同同型和亞類的一抗在熒光 WB中進(jìn)行多重檢測(cè)成為可能。
（4）Fc片段特異性二抗用途廣泛，因?yàn)樗鼈円部捎米髅庖邷y(cè)定中的捕獲或檢測(cè)抗體。
缺點(diǎn)：
（1）通常比H+L特異性二抗靈敏度更低。
（2）免疫細(xì)胞樣本中的Fc受體可能造成干擾。
（3）在免疫沉淀后使用時(shí)，F(xiàn)c特異性二抗會(huì)結(jié)合天然一抗IgG以及變性IgG的50 kD重鏈。如果一抗蛋白靶標(biāo)在~50 kD處運(yùn)行，這可能會(huì)干擾靶標(biāo)檢測(cè)。
F(ab) 或 F(ab')2 特異性
二抗與一抗的 F(ab) 或 F(ab')2 部分結(jié)合，檢測(cè)重鏈或輕鏈
F(ab)和F(ab')2 特異性二抗在蛋白質(zhì)印跡法中并不常用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)用于蛋白質(zhì)印跡法的一抗都由重鏈和輕鏈組成。一抗Fc區(qū)的作用是為免疫球蛋白上的二抗結(jié)合提供額外的空間，從而實(shí)現(xiàn)更靈敏的靶標(biāo)檢測(cè)。
優(yōu)點(diǎn)：
（1）結(jié)合與重鏈特異性無(wú)關(guān)。二抗將與所有具有相同輕鏈的免疫球蛋白類別和同種型結(jié)合。
（2）當(dāng)檢測(cè)已知輕鏈組成的一抗時(shí)，可以使用Kappa鏈與 Lambda鏈特異性的二抗來(lái)獲得額外的特異性。
（3）當(dāng)一抗靶標(biāo)在~50 kD處時(shí)，可在免疫沉淀后用于結(jié)合天然一抗IgG。輕鏈特異性二抗僅檢測(cè)變性IgG的 25 kD 輕鏈，而不結(jié)合50 kD重鏈。
缺點(diǎn)：
（1）通常比H+L特異性二抗靈敏度更低。
（2）在免疫沉淀后使用時(shí)，輕鏈特異性二抗會(huì)結(jié)合天然一抗IgG以及變性 IgG的25 kD輕鏈。如果一抗蛋白靶標(biāo)在 ~25 kD處運(yùn)行，這可能會(huì)干擾靶標(biāo)檢測(cè)。
宿主物種和二抗類型（多克隆、單克隆、重組）
多克隆、單克隆和重組二抗以及抗體片段均可用于蛋白質(zhì)印跡法。
多克隆二抗是目前使用最廣泛的二抗形式。它們可識(shí)別一抗上的多個(gè)表位，因此比僅識(shí)別一個(gè)表位或沒(méi)有Fc區(qū)的抗體片段的單克隆抗體更靈敏。
單克隆二抗的價(jià)值在于其批次間一致性，并且在許多情況下具有廣泛的特性和出版歷史。
重組二抗還有其他優(yōu)勢(shì)。除了具有良好的特性和批次間一致性外，它們還可以在特定位點(diǎn)進(jìn)一步修飾，以向天然免疫球蛋白添加所需特性，例如類別轉(zhuǎn)換或位點(diǎn)特異性標(biāo)記。重組抗體可以匯集起來(lái)以生成重組抗體池，例如重組多克隆一抗或超克隆重組二抗。
下表顯示了多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體作為二抗的優(yōu)缺點(diǎn)。
收集來(lái)自不同B細(xì)胞的二抗，這些二抗可識(shí)別同一免疫球蛋白上的多個(gè)表位?？商禺愋葬槍?duì)免疫球蛋白的任何部分，例如 Fc 或 F(ab)。最常用于生成檢測(cè) H+L鏈的二抗。
由相同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的單一抗體，可識(shí)別同一免疫球蛋白抗原上的一個(gè)表位。它們可特異性針對(duì)kappa、lambda 輕鏈以及同種型和亞類。
源自重組DNA的單一抗體。可在DNA水平上進(jìn)行修飾或用于生成確定的抗體池。
靈敏度高。多克隆抗體庫(kù)中的許多抗體可以與一抗上的表位結(jié)合。
批次間一致性。通常具有良好的表征、特定克隆的來(lái)源背景。
穩(wěn)定、長(zhǎng)期供應(yīng)、批次間一致性?？尚薷臑樗杼匦砸蕴岣咝阅?。
批次間差異是可能的，但通常不如一抗那么嚴(yán)重。
檢測(cè)靈敏度取決于單個(gè)表位的豐度和暴露程度。細(xì)胞系漂移可能導(dǎo)致抗體發(fā)生細(xì)微的長(zhǎng)期變化。
非常專業(yè)且依賴表位。開(kāi)發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)?？赡苄枰嗲捌趦?yōu)化。通常價(jià)格較高。
檢測(cè)方法
二抗可以與幾種不同的探針或酶結(jié)合，以檢測(cè)靶抗原。標(biāo)記的選擇取決于應(yīng)用和二抗的檢測(cè)方式。酶報(bào)告基因，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP） 是蛋白質(zhì)印跡中最常用的。這些酶可以與化學(xué)發(fā)光或顯色檢測(cè)方法一起使用。熒光標(biāo)記的二抗也越來(lái)越廣泛地用于檢測(cè)低豐度靶標(biāo)，信噪比也越來(lái)越高。
交叉吸附抗體
進(jìn)行多重蛋白質(zhì)印跡分析時(shí)，請(qǐng)考慮使用高度交叉吸附的二抗來(lái)限制抗體之間的交叉反應(yīng)。交叉吸附是一種純化過(guò)程，有助于消除抗體混合物中的非特異性抗體，例如特定類別、同種型或宿主物種的抗體。
免疫沉淀后WB分析
在免疫沉淀后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析時(shí)，二抗選擇起著重要作用。進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，一抗或?qū)φ誌gG通常與目標(biāo)蛋白一起洗脫。因此，用于蛋白質(zhì)印跡分析的洗脫部分始終含有不同量的IgG。例如，如果使用兔多克隆抗體通過(guò)免疫沉淀富集目標(biāo)蛋白，則當(dāng)使用傳統(tǒng)的HRP偶聯(lián)抗兔 IgG（H+L）二抗時(shí)，洗脫部分中還原和變性的重鏈和輕鏈將在25和50 kD處產(chǎn)生條帶，因?yàn)槎怪苯优c變性的IgG結(jié)合。
如果二抗產(chǎn)生的重鏈和輕鏈不會(huì)干擾一抗的目標(biāo)靶標(biāo)，則只需將這些條帶標(biāo)記為重鏈和輕鏈。然而，當(dāng)目標(biāo)靶標(biāo)可能在約25或50 kD處運(yùn)行時(shí)，可能無(wú)法將目標(biāo)條帶與重鏈或輕鏈條帶區(qū)分開(kāi)來(lái)。
有幾種可以采用的解決方案：
•使用Clean-Blot IP檢測(cè)試劑，該試劑僅檢測(cè)天然一抗，而不檢測(cè)免疫沉淀洗脫級(jí)分中的變性IgG。
•如果目標(biāo)靶點(diǎn)為~25 kD（輕鏈干擾），則使用Fc特異性二抗。
•如果目標(biāo)蛋白分子量約為50 kD（重鏈干擾），則使用輕鏈特異性二抗。
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