3T3-L1細(xì)胞是一種從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中分離得到的細(xì)胞系，具有從快速分裂的前脂肪細(xì)胞向脂肪樣細(xì)胞分化的特性。

         最早于1974年由Green和Kehinde等人從小鼠胚胎中分離得到。由于其具備在體外分化為類脂肪細(xì)胞的能力，這種細(xì)胞系被廣泛用于研究脂肪細(xì)胞的分化、代謝以及肥胖和糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制。

         對(duì)于誘導(dǎo)效果的檢測(cè)有多種方式，其中油紅O染色是檢測(cè)脂肪細(xì)胞脂滴積累的經(jīng)典方法，可用于直觀評(píng)估細(xì)胞的脂肪化程度。油紅O是一種脂溶性染料，能夠特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的中性脂質(zhì)，形成紅色的脂滴?？梢栽陲@微鏡下觀察脂滴的形成，當(dāng)觀察到脂滴數(shù)量和大小的增加則表明誘導(dǎo)分化成功。

         另外也可以通過分子標(biāo)志物檢測(cè)的方式來判斷誘導(dǎo)效果，比如通過檢測(cè)脂肪細(xì)胞特異性基因或蛋白的表達(dá)，評(píng)估細(xì)胞的分化程度。常用的基因標(biāo)志物包括PPARγ（過氧化物酶體增殖物激活受體γ）、aP2（脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白）、LPL（脂蛋白脂肪酶）等?；蛘咄ㄟ^Western Blot檢測(cè)基因所對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)水平。此外，誘導(dǎo)分化后的3T3-L1細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。此形態(tài)學(xué)變化也可作為是否成功誘導(dǎo)的初步判斷依據(jù)。

         本篇以六孔板為例，介紹3T3-L1細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案。

第 1 階段   細(xì)胞培養(yǎng)

1.以每平方厘米3×103個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種于六孔板中。

        注意：

     （1）建議使用早代次的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確保分化效果。

     （2）鋪板需均勻，鋪板不均勻可能會(huì)導(dǎo)致分化不均勻，分化比例低，分化過程中細(xì)胞漂浮。

2.在DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞，直至達(dá)到70%的匯合度，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。

         3T3-L1細(xì)胞通常在DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入10%小牛血清或胎牛血清以促進(jìn)細(xì)胞生長。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中（37℃，5% CO?）生長至匯合度達(dá)到90%左右時(shí)，即可進(jìn)行分化誘導(dǎo)。

         分化前的匯合度不應(yīng)超過70%，否則會(huì)增加分化后的細(xì)胞死亡。

        注意：

     （1）使用高血清含量的培養(yǎng)基可以促進(jìn)脂肪積累。

     （2）細(xì)胞密度是影響分化效果的關(guān)鍵因素，匯合度過高或過低都會(huì)影響分化效率。

第 2 階段   分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制

         培養(yǎng)基制備必須在組織培養(yǎng)箱中無菌條件下進(jìn)行。MDI（甲基異丁基黃嘌呤IBMX、地塞米松、胰島素）誘導(dǎo)培養(yǎng)基和胰島素培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.制備儲(chǔ)備溶液。

         在DMSO中制備 IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的儲(chǔ)備溶液。如果使用凍干胰島素，請(qǐng)根據(jù)制造商的說明進(jìn)行復(fù)溶。

2.配置100 mL MDI誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

3.配置胰島素培養(yǎng)基。

         在DMEM中加入胰島素至最終濃度為10 µg/mL。

第 3 階段   3T3-L1 細(xì)胞向脂肪樣細(xì)胞的分化

實(shí)驗(yàn)步驟

1.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，去除DMEM培養(yǎng)基，并每孔添加2-3 mL MDI誘導(dǎo)培養(yǎng)基（記為第0天）。

        注意：

     （1）3T3-L1細(xì)胞添加誘導(dǎo)劑時(shí)，手法要特別輕，加液時(shí)盡量讓槍頭沿著側(cè)壁緩慢加入，減小對(duì)細(xì)胞的沖擊，防止細(xì)胞卷邊飄起。

     （2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基需要提前37℃預(yù)熱后使用，減小對(duì)細(xì)胞的刺激。

2.第3天，從細(xì)胞中去除MDI誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并用2-3 mL胰島素培養(yǎng)基替換。

3.第6天，去除胰島素培養(yǎng)基并添加新鮮的DMEM。

4.一般到第7-10天，能獲得完全分化的脂肪樣細(xì)胞。

5.分化效果檢測(cè)?？梢酝ㄟ^油紅O染色來追蹤向脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞的分化，以監(jiān)測(cè)脂質(zhì)積累，或通過監(jiān)測(cè)脂肪細(xì)胞標(biāo)志物（例如脂聯(lián)素和 FABP4）的表達(dá)來追蹤。

         注意：飽和油紅O染色液不容易著色，染色前油紅O染色液需要根據(jù)說明書進(jìn)行稀釋。

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