細胞復蘇

1. 將MEF P0細胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml MEF完全培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF完全培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。

4. 輕輕吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。

5. 按照MEF細胞說明書上建議的復蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至1個T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)液14 ml。

6. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

7.復蘇第二天觀察，如死細胞較多，更換新鮮的MEF完全培養(yǎng)液，可以使細胞生長的更好。

細胞傳代

1. 待細胞長到90%-100%滿時進行傳代，一般3-4天，具體視細胞生長情況而定。

2. 吸除廢液。

3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。

6. 加2.5 ml MEF完全培養(yǎng)液終止消化。

7. 多次輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液。

8. 按照1:2-1:3的比例進行傳代。

9. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

細胞凍存

1. 按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。

2. 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預冷的凍存液，懸浮細胞。

3. 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方：MEF完全培養(yǎng)液80%，F(xiàn)BS10%，DMSO10%

絲裂霉素C處理

1. 一般地，P0代MEF細胞傳至P3代時，可以進行絲裂霉素C（Sigma，M0503）處理。處理過后的MEF細胞不再增殖，可直接作為feeder使用。

2. 傳至P3代的MEF細胞長至80%以上時，吸出舊的MEF完全培養(yǎng)液，加入含絲裂霉素C（終濃度10 μg/ml）的新鮮MEF完全培養(yǎng)液（以T75培養(yǎng)瓶為例，加入培養(yǎng)液的體積為10 ml）。37℃培養(yǎng)箱溫育處理3小時。

3. 吸出培養(yǎng)液，用PBS快速洗4遍以去除殘余的絲裂霉素C。

4. 消化細胞、細胞計數(shù)并凍存。一般地，一個T25培養(yǎng)瓶鋪1×10⁶細胞。