磷酸化EGFR (Y1068) 檢測(cè)試劑盒是一種均相的時(shí)間分辨福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）夾心免疫分析。THUNDER™細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)工作流程包括三個(gè)步驟。在細(xì)胞處理后，首先使用試劑盒中提供的特定裂解緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。然后，利用一對(duì)熒光標(biāo)記抗體在簡(jiǎn)單的“添加-孵育-測(cè)量”格式中檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的磷酸化EGFR (Y1068)（單步試劑添加；無(wú)需洗滌步驟）。其中一種抗體用供體熒光染料（銪螯合物；Eu-Ab1）標(biāo)記，另一種則用遠(yuǎn)紅色受體熒光染料（FR-Ab2）標(biāo)記。兩種標(biāo)記抗體與目標(biāo)蛋白上不同的表位結(jié)合，發(fā)生在溶液中，使兩種染料靠近。用閃光燈（320或340 nm）或激光（337 nm）激發(fā)供體銪螯合物分子后，會(huì)觸發(fā)從供體到受體分子的FRET，進(jìn)而在665 nm處發(fā)出TR-FRET信號(hào)。銪螯合物殘余能量會(huì)在615 nm處產(chǎn)生光信號(hào)。665 nm處的信號(hào)與細(xì)胞裂解液中磷酸化EGFR (Y1068) 的濃度成正比。數(shù)據(jù)可以表示為665 nm處的信號(hào)或665 nm與615 nm的比值。
艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸化EGFR(Y1068)TR-FRET細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)試劑盒#KIT-EGFRP-100組成：
Eu-磷酸化EGFR（5 µL）
Acc-磷酸化EGFR（20 µL）
EGFR對(duì)照裂解液（100 µL）
5倍裂解緩沖液1（1 mL）
10倍TR-FRET檢測(cè)緩沖液（50 µL）
100倍磷酸酶抑制劑混合液（50 µL）
互補(bǔ)試劑：
THUNDER™ EGFR對(duì)照裂解液
THUNDER™裂解緩沖液1（5倍）
THUNDER™ TR-FRET檢測(cè)緩沖液（10倍）
THUNDER™磷酸酶抑制劑混合液（100倍）
驗(yàn)證數(shù)據(jù)
本試劑盒已通過(guò)驗(yàn)證，可用于使用2板檢測(cè)協(xié)議對(duì)A431細(xì)胞裂解液中磷酸化EGFR (Y1068) 的相對(duì)定量檢測(cè)。
細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)（DMEM + 10% FBS）。
細(xì)胞處理：細(xì)胞處理后，移除培養(yǎng)基，用1X裂解緩沖液1（50 µL）裂解細(xì)胞，裂解緩沖液中補(bǔ)充了稀釋1倍的100倍磷酸酶抑制劑混合液。
孵育與檢測(cè)：在室溫下于振蕩器（400 rpm）孵育30分鐘后，將裂解液（15 µL）轉(zhuǎn)移至384孔檢測(cè)板，并加入標(biāo)記抗體Eu-Ab1和FR-Ab2（5 µL）用于檢測(cè)磷酸化EGFR (Y1068)。
信號(hào)讀?。涸谑覝胤跤?小時(shí)后，記錄665 nm和615 nm處的TR-FRET信號(hào)（EnVision®；燈激發(fā)）。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：
A431細(xì)胞（每孔4萬(wàn)細(xì)胞，三重復(fù)）與EGF的系列稀釋液在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，EGF處理可刺激A431細(xì)胞中EGFR在Y1068位點(diǎn)的磷酸化。
A431細(xì)胞（每孔4萬(wàn)細(xì)胞，三重復(fù)）與Cetuximab的系列稀釋液在室溫下孵育30分鐘，隨后用50 nM EGF在室溫下刺激10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Cetuximab處理可抑制EGF誘導(dǎo)的A431細(xì)胞中EGFR在Y1068位點(diǎn)的磷酸化。
A431細(xì)胞（每孔4萬(wàn)細(xì)胞，三重復(fù)）分別在有無(wú)50 nM EGF的條件下在室溫下孵育10分鐘。每組處理使用48個(gè)孔來(lái)確定Z'因子值。Z'因子值為0.73，表明該檢測(cè)方法穩(wěn)健且適用于高通量篩選（HTS）。
磷酸化EGFR (Y1068) 檢測(cè)試劑盒常規(guī)測(cè)試使用EGF處理的A431細(xì)胞裂解液。A431細(xì)胞在T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至100%匯合，用100 nM EGF在室溫下刺激10分鐘。細(xì)胞裂解后，用1X裂解緩沖液1對(duì)裂解液進(jìn)行系列稀釋，并進(jìn)行三重復(fù)檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示，裂解液稀釋度與TR-FRET比值呈線性關(guān)系。
艾美捷科技是BioAuxilium的中國(guó)區(qū)域合作伙伴，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。
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