總BTK檢測試劑盒是一種均相的時間分辨福斯特共振能量轉移（TR-FRET）夾心免疫分析（見圖1）。THUNDER™細胞信號檢測工作流程包括三個步驟。在細胞處理后，首先使用試劑盒中提供的特定裂解緩沖液對細胞進行裂解。然后，利用一對熒光標記抗體在簡單的“添加-孵育-測量”格式中檢測細胞裂解液中的總BTK（單步試劑添加；無需洗滌步驟）。其中一種抗體用供體熒光染料（銪螯合物；Eu-Ab1）標記，另一種則用遠紅色受體熒光染料（FR-Ab2）標記。兩種標記抗體與目標蛋白上不同的表位結合，發(fā)生在溶液中，使兩種染料靠近。用閃光燈（320或340 nm）或激光（337 nm）激發(fā)供體銪螯合物分子后，會觸發(fā)從供體到受體分子的FRET，進而在665 nm處發(fā)出TR-FRET信號。銪螯合物殘余能量會在615 nm處產生光信號。665 nm處的信號與細胞裂解液中總BTK的濃度成正比。數(shù)據(jù)可以表示為665 nm處的信號或665 nm與615 nm的比值。
艾美捷BioAuxilium-THUNDER全BTK TR-FRET細胞信號檢測試劑盒#KIT-BTKT-100組成：
Eu-Total BTK（5 µL）
Acc-Total BTK（20 µL）
BTK對照裂解液（100 µL）
5倍裂解緩沖液2（1 mL）
10倍TR-FRET檢測緩沖液（50 µL）
10倍磷酸酶抑制劑混合液（50 µL）
互補試劑：
THUNDER™裂解緩沖液2（5倍）
THUNDER™ TR-FRET檢測緩沖液（10倍）
THUNDER™磷酸酶抑制劑混合液（100倍）
驗證數(shù)據(jù)：
本試劑盒已通過驗證，可用于使用2板檢測協(xié)議對Raji細胞裂解液中總BTK的相對定量檢測。
細胞培養(yǎng)：非貼壁細胞在RPMI+10% FBS中培養(yǎng)，隨后經過離心并重懸于無血清的RPMI中，達到所需密度。
細胞處理：細胞處理后，使用5倍裂解緩沖液2（最終濃度為1倍）裂解細胞，裂解緩沖液中補充了稀釋5倍的100倍磷酸酶抑制劑混合液。
孵育與檢測：在室溫下于振蕩器（400 rpm）孵育30分鐘后，將裂解液（15 µL）轉移至384孔檢測板，并加入標記抗體Eu-Ab1和FR-Ab2（5 µL）用于檢測總BTK。
信號讀?。涸谑覝胤跤?小時后，記錄665 nm和615 nm處的TR-FRET信號（EnVision®；燈激發(fā)）。
實驗數(shù)據(jù)：
Raji細胞（每孔20萬細胞，三重復）與Pervanadate的系列稀釋液在37℃下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Pervanadate處理可刺激Raji細胞中BTK在Y223位點的磷酸化，但對總BTK水平沒有顯著影響。
Raji細胞（每孔20萬細胞，三重復）與Ibrutinib的系列稀釋液在37℃下孵育60分鐘，隨后用150 µM Pervanadate在37℃下刺激30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Ibrutinib處理可抑制Pervanadate誘導的Raji細胞中BTK在Y223位點的磷酸化，但對總BTK水平沒有顯著影響。
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