磷酸化BTK (Y223) 檢測試劑盒是一種均相的時間分辨福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）夾心免疫分析。THUNDER™細胞信號檢測工作流程包括三個步驟（見圖2）。在細胞處理后，首先使用試劑盒中提供的特定裂解緩沖液對細胞進行裂解。然后，在簡單的“添加-孵育-測量”格式中，利用一對熒光標記抗體檢測細胞裂解液中的磷酸化BTK (Y223)（單步試劑添加，無需洗滌步驟）。其中一種抗體用供體熒光染料（銪螯合物；Eu-Ab1）標記，另一種則用遠紅色受體熒光染料（FR-Ab2）標記。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER 磷酸化BTK (Y223)時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移細胞信號檢測試劑盒#KIT-BTKP-100檢測原理：

這兩種標記抗體與目標蛋白上不同的表位結(jié)合，發(fā)生在溶液中，使兩種染料靠近。用閃光燈（320或340 nm）或激光（337 nm）激發(fā)供體銪螯合物分子后，會觸發(fā)從供體到受體分子的FRET，進而在665 nm處發(fā)出TR-FRET信號。銪螯合物殘余能量會在615 nm處產(chǎn)生光信號。665 nm處的信號與細胞裂解液中磷酸化BTK (Y223) 的濃度成正比。數(shù)據(jù)可以表示為665 nm處的信號或665 nm與615 nm的比值。

試劑盒組成：

Eu-Phospho-BTK（5 µL）

Acc-Phospho-BTK（20 µL）

BTK對照裂解液（500 µL）

5倍裂解緩沖液2（1 mL）

10倍TR-FRET檢測緩沖液（50 µL）

100倍磷酸酶抑制劑混合液（50 µL）

互補試劑：

THUNDER™裂解緩沖液2（5倍）

THUNDER™ TR-FRET檢測緩沖液（10倍）

THUNDER™磷酸酶抑制劑混合液（100倍）

驗證數(shù)據(jù)：

本試劑盒已通過驗證，可用于使用2板檢測協(xié)議對Raji細胞裂解液中磷酸化BTK（Y223）的相對定量檢測。

細胞培養(yǎng)：非貼壁細胞在RPMI+10% FBS中培養(yǎng)，隨后經(jīng)過離心并重懸于無血清的RPMI中，達到所需密度。

細胞處理：細胞處理后，使用5倍裂解緩沖液2（最終濃度為1倍）裂解細胞，裂解緩沖液中補充了稀釋5倍的100倍磷酸酶抑制劑混合液。

孵育與檢測：在室溫下于振蕩器（400 rpm）孵育30分鐘后，將裂解液（15 µL）轉(zhuǎn)移至384孔檢測板，并加入標記抗體Eu-Ab1和FR-Ab2（5 µL）用于檢測磷酸化BTK（Y223）。

信號讀?。涸谑覝胤跤?小時后，記錄665 nm和615 nm處的TR-FRET信號（EnVision®）。

實驗數(shù)據(jù)：

在96孔細胞培養(yǎng)板中，Raji細胞（每孔20萬細胞，三重復）與Pervanadate的系列稀釋液在37℃下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Pervanadate處理可刺激Raji細胞中BTK在Y223位點的磷酸化。

Raji細胞（每孔20萬細胞，三重復）與Ibrutinib的系列稀釋液在37℃下孵育60分鐘，隨后用150 µM Pervanadate在37℃下刺激30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Ibrutinib處理可抑制Pervanadate誘導的Raji細胞中BTK在Y223位點的磷酸化。

Raji細胞（每孔20萬細胞）分別在有無200 µM Pervanadate的條件下在37℃下孵育30分鐘。每組處理使用48個孔來確定Z'因子值。Z'因子值為0.74，表明該檢測方法穩(wěn)健且適用于高通量篩選（HTS）。

Phospho-BTK (Y223)檢測試劑盒常規(guī)測試使用Pervanadate處理的Raji細胞裂解液。Raji細胞經(jīng)培養(yǎng)、離心后，以1000萬細胞/mL的密度重懸，并用200 µM Pervanadate在37℃下刺激30分鐘。細胞裂解后，用5倍裂解緩沖液2（最終濃度：1倍）對裂解液進行系列稀釋，并進行三重復檢測。數(shù)據(jù)顯示，裂解液稀釋度與TR-FRET比值呈線性關系。

艾美捷科技是BioAuxilium的中國區(qū)域合作伙伴，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務。

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