固定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)方案
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中用于研究蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)表達(dá)狀態(tài)的重要技術(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需求和條件，可以采用不同的免疫沉淀方法，主要包括磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。
磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠與特定抗體結(jié)合，進(jìn)而捕獲目標(biāo)蛋白。這種方法的特點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便、快速，且分離效率高，特別適合高通量篩選和自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)。磁珠通過(guò)磁性分離架進(jìn)行快速分離，使得實(shí)驗(yàn)步驟更加簡(jiǎn)潔。此外，磁珠免疫沉淀法在研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)途徑時(shí)尤為有用。
固定免疫沉淀法則使用固定化的抗體（通常是抗體偶聯(lián)到珠子上）捕獲目標(biāo)蛋白，通常用于蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）分析前的樣品準(zhǔn)備。這種方法需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間來(lái)形成免疫復(fù)合物，但能提供高特異性和靈敏度的結(jié)果，適合于定量分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)和修飾狀態(tài)。固定免疫沉淀法在研究蛋白質(zhì)表達(dá)水平、翻譯后修飾或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性時(shí)尤為重要。
之前介紹過(guò)磁珠免疫沉淀法的具體操作，本文將針對(duì)固定免疫沉淀法的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行具體描述。
所需溶液與試劑
（1）PBS緩沖液。
（2）1× 細(xì)胞裂解緩沖液：20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM焦磷酸鈉、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml亮抑酶肽。
（3）3× SDS樣品緩沖液：187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30%甘油，150 mM DTT，0.03% w/v溴酚藍(lán)。
注：以上溶液均用超純水制備。
細(xì)胞裂解液在使用前添加1 mM PMSF。
1.制備細(xì)胞裂解物
1.1吸干培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，添加含有調(diào)節(jié)因子的新鮮培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞處理一段時(shí)間。
1.2去除培養(yǎng)基，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞一次。
1.3去除PBS，每塊細(xì)胞培養(yǎng)板（10 cm）添加0.5 ml預(yù)冷的1× 細(xì)胞裂解緩沖液和1 mM PMSF。
1.4置于冰上孵育5分鐘。
1.5從板上輕輕刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至微量離心管，置于冰上。
1.6在冰上對(duì)樣品超聲處理四次，每次5秒。
1.7在4°C下微量離心10分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到一根新的試管中。
1.8盡快進(jìn)入下一步，如暫時(shí)不進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，需將裂解物保存在-80°C。
2.免疫沉淀法
2.1取200 μl細(xì)胞裂解物，并添加10 µl固定抗體，置于搖床上輕輕搖動(dòng)，在4°C下孵育過(guò)夜。
2.2于4°C條件下微量離心30秒。
2.3用500 µl的1×細(xì)胞裂解緩沖液，重懸沉淀物進(jìn)行清洗，然后離心去除上清，共清洗五次。洗滌間期，保持樣品于冰上。
2.4使用20 μl 3× SDS樣品緩沖液重懸沉淀物。渦旋振蕩，然后再微量離心30秒。
2.5加熱樣品到95-100°C，并持續(xù)2-5分鐘。
2.6取15-30 µl樣品上樣到SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（請(qǐng)參閱蛋白質(zhì)免疫印跡法實(shí)驗(yàn)步驟）。
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