在雜質(zhì)的研究中，除了對雜質(zhì)做定性研究之外，很多時候也需要做定量方面的研究，從而能比較準(zhǔn)確地了解雜質(zhì)的真實含量，和高效液相數(shù)據(jù)的匹配度如何，為進(jìn)一步把控藥物工藝路線中的中間體、終產(chǎn)API和藥物制劑中所含有的雜質(zhì)提供更可靠的事實依據(jù)。目前，國內(nèi)雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的定量研究，主要采用兩種方法：質(zhì)量平衡法，包括熱重分析（Thermogravimetric Analysis，TG或TGA）技術(shù)以及水分加溶劑殘留技術(shù)；另外就是定量核磁（Quantitative Nuclear Magnetic）方法。在SINCO藥物標(biāo)準(zhǔn)品研究和銷售中，很多客戶會要求選擇上述方法之一來對要購買的藥物雜質(zhì)進(jìn)行定量分析。
作為一門近年來比較熱門的分析技術(shù)，如果不能很好地理解它的技術(shù)特點和要求，難免會引起認(rèn)知上的困擾和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，影響與客戶的順利溝通。結(jié)合我們工作中遇到的一些問題，糅合相關(guān)信息資料，拋磚引玉，談?wù)勎覀儗Χ亢舜诺囊恍\顯認(rèn)識。
整個定量核磁的檢測過程包括：待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品（內(nèi)標(biāo)物）的準(zhǔn)備，樣品的稱量，配（氘代溶）液和轉(zhuǎn)移，進(jìn)行qNMR檢測，數(shù)據(jù)處理與計算這五個步驟（圖1）。我們知道分析誤差是可以疊加的，分析過程中每一個步驟產(chǎn)生的誤差，會最終加合到一起，所以需要從最開始的樣品稱量就要力爭免除不必要的誤差。
圖1. qNMR檢測流程
具體來說，稱量的時候要做到如下要求：
1.使用按規(guī)范校準(zhǔn)過的超微量天平（即十萬分之一天平）；
2.稱量前要清潔桌面；
3.稱量前要把天平的稱量臺面清潔干凈；
4.稱量時使用鑷子，而不是直接用手（手指會沾染樣品，造成樣品量損失）；
5.在第一次稱量前，先將一個空樣品瓶放在天平稱量臺面數(shù)分鐘；
6.檢查天平附近有沒有磁性物體；
7.用邊緣比較薄的樣品瓶稱量；
8.稱量前，輕輕地敲擊樣品瓶，使得粘附的樣品抖落到瓶底；
9.樣品瓶在稱量臺上的時候，不要往瓶里加樣品；
10.稱量時完全關(guān)閉天平門，杜絕氣流的影響；
11.調(diào)零前，要等天平顯示數(shù)據(jù)先穩(wěn)定下來；
12.將樣品瓶儲存在天平附近；
13.為避免誤差過大，樣品稱量的量>10 mg為宜。
PART1---標(biāo)準(zhǔn)樣品或內(nèi)標(biāo)物的選擇：
標(biāo)準(zhǔn)樣品或內(nèi)標(biāo)物通常結(jié)構(gòu)簡單，有一組或兩組核磁出峰。具有較高的純度（≥99%），吸濕性不強，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以長久保存，不揮發(fā)，且溶于指定的氘代溶劑中，不與待測樣品的定量峰互相干擾重疊。因為有部分內(nèi)標(biāo)物仍會微量吸潮，所以內(nèi)標(biāo)物要求置于干燥器中保存。
下面表格是幾種常用內(nèi)標(biāo)物的相關(guān)數(shù)據(jù)歸納，可以供研究人員參考選擇：
表1：常用定量核磁標(biāo)準(zhǔn)品
PART2---氘代溶液配制：
氘代溶劑一般根據(jù)內(nèi)標(biāo)物及待測樣品的性質(zhì)來定。盡可能消除活潑質(zhì)子的影響，使樣品完全溶解：
1. 不含活潑質(zhì)子的非極性化合物，可選用氘代氯仿做溶劑；
2. 含活潑質(zhì)子的極性化合物，常用的溶劑有DMSO-d6+D2O(加重水是為了消除活潑質(zhì)子的影響)、D2O和CD3OD等；
3. 如果用DMSO-d6+D2O作溶劑，一般兩者的比例為5:1。兩者比例可做適當(dāng)調(diào)整，保證混合樣品完全溶解；
4. 既不溶于有機溶劑，也不溶于水，比如氨基酸類兩性化合物等，可以采用DMSO-d6/D2O+酸/堿的方法。需要保證酸/堿不會影響待測物和內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性；
5. 對于一些特殊結(jié)構(gòu)的樣品，如果其特征信號在水峰附近，很難保證基線的水平，會影響測定結(jié)果?？捎玫姆椒ㄊ羌尤隩FA移除水峰。需要保證TFA不影響待測物的穩(wěn)定。
PART3---qNMR檢測：
進(jìn)行qNMR檢測的時候，因為考慮到要對峰面積精準(zhǔn)積分，所以檢測方法的一些數(shù)據(jù)設(shè)定也有要求（核磁檢測軟件中進(jìn)行設(shè)置，此處不做介紹）。一般要求D1>5T1；S/N>150 (即信噪比)。T1（即弛豫時間）一般為1s，D1（即延遲時間）一般選5-10s。延遲時間（D1）直接影響激發(fā)核能否恢復(fù)至平衡基態(tài)，而能否恢復(fù)基態(tài)影響核磁的響應(yīng)信號。因此合適的D1對qNMR定量結(jié)果影響較大。但過長的D1又會增加單次掃描所需的時間。
在實際操作中，如需縮短延遲時間，可以通過加入順磁物質(zhì)。而如果D1過短，可以引入校正因子f校正D1時間不足導(dǎo)致的定量偏差。就掃描時間而言，相同操作條件下，靈敏度與掃描次數(shù)呈正比。如果掃描次數(shù)太少，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性會較差。但如果掃描次數(shù)過多，則會造成試驗效率低下。因此qNMR定量需優(yōu)化掃描次數(shù)，是掃描時間和靈敏度達(dá)到最佳平衡。
PART4---數(shù)據(jù)處理與計算：
牽扯到數(shù)據(jù)分析的時候，因為待測樣品往往出峰復(fù)雜，所以選擇哪個或哪幾個核磁峰為定量峰也有講究。一般盡可能保證信號峰間的基線分離；定量峰峰形盡可能類似；定量峰盡可能靠近（如果標(biāo)準(zhǔn)樣品峰與定量峰相隔太遠(yuǎn)，對基線校正的要求極高，誤差大）；二者峰面積盡可能接近；衛(wèi)星峰盡可能不干擾測定結(jié)果等。另外標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的摩爾量（有效）要接近，不然誤差也是比較大的。這些對于含量比較高的API或其工作對照品，影響會比較明顯。
對于待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中一個或兩者均有一個以上可用定量峰的情況下，需做合理選擇。如果同一成分的可用定量峰的積分值接近，可取其平均值；如果其積分值有一定差距，建議采用積分值小的那個，一般結(jié)果比較合理。
以上是SINCO藥物標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)分析研究人員在定量核磁的檢測和分析中，綜合有關(guān)文獻(xiàn)信息，加上自身經(jīng)驗的總結(jié)，得到的一些淺薄認(rèn)知，希望能和國內(nèi)的眾多標(biāo)準(zhǔn)品研究人員相互學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步。
Sinco Pharmachem（簡稱SINCO），專業(yè)為化學(xué)藥物領(lǐng)域的科學(xué)家提供復(fù)雜有機小分子化合物、雜質(zhì)對照品、API標(biāo)準(zhǔn)品、穩(wěn)定同位素。
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