背景^[1-3]

C-ABL抗體是一種IgG1κ小鼠單克隆c-Abl抗體（也稱為ABL1抗體、ABL原癌基因1抗體或非受體酪氨酸激酶抗體），可通過(guò)WB、IP、IF、IHC(P)和ELISA檢測(cè)小鼠、大鼠和人類的c-Abl蛋白。c-Abl抗體（8E9）既可以作為非共軛抗c-Abl抗體，也可以作為多種共軛形式的抗c-Abl抗體，包括瓊脂糖、HRP、PE、FITC和多種共軛物。Abl癌基因最初被鑒定為Abelson小鼠白血病病毒（A-MuLV）的病毒轉(zhuǎn)化基因。c-Abl的主要翻譯產(chǎn)物已被鑒定為具有酪氨酸激酶活性和SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。Abl癌基因與幾種人類白血病有關(guān)，包括90-95%的慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）、20-25%的成人急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）和2-5%的兒童ALL。在這些白血病中，c-Abl原癌基因經(jīng)歷（9；22）染色體易位，產(chǎn)生費(fèi)城（Ph1）染色體。這種易位的分子結(jié)果是產(chǎn)生編碼活化的Abl蛋白酪氨酸激酶的嵌合Bcr/c-Abl mRNA。已證明Bcr基因編碼一種針對(duì)Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白p21rac的GTP酶激活蛋白（GAP）。

C-ABL抗體

C-ABL抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（C-ABL抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(C-ABL抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

C-ABL抗體可以用于c-Abl在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)及其惡性行為作用機(jī)制的初步探討

c-Abl在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義目的檢測(cè)在不同EOC標(biāo)本中c-Abl蛋白表達(dá)情況，探討c-Abl的表達(dá)與EOC患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性。

方法：（1）采用C-ABL抗體免疫組織化學(xué)測(cè)定22例正常卵巢組織，28例良性卵巢腫瘤組織，18例交界性卵巢腫瘤組織及137例EOC組織標(biāo)本中c-Abl的表達(dá)情況，分析c-Abl的異常表達(dá)與其臨床病理特征的相關(guān)性。（2）采用C-ABL抗體Western blot測(cè)定18例正常卵巢組織標(biāo)本，17例卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本，14例卵巢交界性腫瘤組織標(biāo)本和32例EOC組織標(biāo)本中c-Abl的表達(dá)情況，分析c-Abl的異常表達(dá)與其臨床病理特征的相關(guān)性。（3）應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析比較不同EOC組織標(biāo)本中c-Abl表達(dá)強(qiáng)弱對(duì)患者生存時(shí)間的影響；Cox回歸分析研究關(guān)于EOC患者生存時(shí)間的相關(guān)影響因素。（4）采用C-ABL抗體Western blot檢測(cè)不同人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3、3AO、OVCAR-3、ES-2）中c-Abl蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)探究c-Abl在人卵巢癌細(xì)胞株中的亞細(xì)胞定位。

C-ABL抗體結(jié)果：（1）免疫組化結(jié)果顯示，在137例EOC組織標(biāo)本中，c-Abl呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)有94例（68.6%），低表達(dá)或不表達(dá)者有43例（31.4%）；在正常卵巢組織21例（95.5%）、卵巢良性腫瘤24例（85.7%）及卵巢交界性腫瘤14例（77.8%）呈c-Abl不表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。在EOC中，F(xiàn)IGO分期中III～I(xiàn)V期的c-Abl蛋白表達(dá)水平顯著高于I～I(xiàn)I期組織（P＜0.001），c-Abl表達(dá)水平在病理分化程度為中低分化顯著高于高分化者（P＜0.001），c-Abl表達(dá)水平在EOC患者血漿Ca-125≥35U/ml的顯著高于Ca-125＜35U/ml（P=0.019），c-Abl表達(dá)在術(shù)后殘余腫瘤直徑≥1cm的EOC患者顯著高于術(shù)后殘余腫瘤直徑＜1cm者（P=0.015），但與EOC患者腹水情況、病灶單雙側(cè)、年齡、腫瘤大小及病理學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05）。（2）C-ABL抗體Western blot結(jié)果顯示，EOC組織標(biāo)本中c-Abl的表達(dá)顯著高于正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢交界性腫瘤組織(分別為：1.704±0.382，0.317±0.062，0.334±0.066，0.346±0.068)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在EOC組織中，c-Abl蛋白表達(dá)水平與EOC組織分化程度、術(shù)后殘余腫瘤直徑大小、患者血漿Ca-125水平、FIGO腫瘤分期有關(guān)（P＜0.05），而與EOC患者腹水情況、病灶單雙側(cè)、年齡、腫瘤大小及病理學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05）。（3）Kaplan-Meier生存分析顯示，c-Abl高表達(dá)的EOC患者生存時(shí)間顯著短于c-Abl低表達(dá)的患者（P＜0.05），多變量分析表明不滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)、c-Abl高表達(dá)和FIGO分期中晚期可能是EOC預(yù)后的獨(dú)立因素。（4）c-Abl在SKOV3、3AO、ES-2、OVCAR-3中的表達(dá)分別為：1.044±0.138，0.905±0.096，0.943±0.170，0.855±0.750；通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到c-Abl與肌動(dòng)蛋白共表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上。

參考文獻(xiàn)

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