背景^[1-3]

DGKD抗體是一種可以特異性結(jié)合DGKD的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的DGKD蛋白。DGKD抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

DGKD抗體

DGKD抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿(mǎn)tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（DGKD抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(DGKD抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

DGKD抗體可以用于亮氨酸缺失對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)功能研究

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究肝臟中受亮氨酸缺失調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)DGKD抗體鑒定到亮氨酸缺失上調(diào)SP代謝相關(guān)基因Sgms1、Cers6、Acer2和Asah1的表達(dá)水平;而在GL和GP代謝中,亮氨酸缺失上調(diào)Pnpla2、Dgkd、Lpin1、Plpp2和Plpp3基因表達(dá)水平,下調(diào)Gpam、Lpic和Agpat2基因表達(dá)水平?；蚣患治?GSEA)結(jié)果表明亮氨酸缺失抑制了肝臟中一系列脂質(zhì)代謝相關(guān)的信號(hào)通路,包括脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸合成、丁酸代謝、丙酮酸代謝、PPAR信號(hào)通路等,同時(shí)激活MAPK和磷脂酶D信號(hào)通路。i TRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明亮氨酸缺失顯著下調(diào)了脂肪酸合成相關(guān)蛋白(如ACACA、ACACB、ACSL5)和脂肪酸去飽和酶(如FADS1、FADS2、ACOD1)的表達(dá)水平。隨后,本研究將脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析,確定了亮氨酸缺失調(diào)控SP代謝(Sgms1、Cers6、Acer2和Asah1)、GL和GP代謝(Pnpla2、Dgkd、Lpin1、Gpam、和Agpat2)的關(guān)鍵基因表達(dá)。在體外試驗(yàn)中,亮氨酸剝奪處理AML12細(xì)胞0、12、24、48小時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理超過(guò)12小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)SM含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)增加。而PI染色結(jié)果顯示亮氨酸剝奪超過(guò)12小時(shí)后,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常,細(xì)胞死亡(或細(xì)胞膜受損)顯著增加。DGKD抗體Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),-Leu小鼠肝臟組織和AML12細(xì)胞中SGMS1蛋白表達(dá)水平隨亮氨酸缺失時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,這進(jìn)一步證明了SGMS1是亮氨酸缺失導(dǎo)致肝臟SM水平增加的關(guān)鍵蛋白。此外,體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果均表明亮氨酸缺失會(huì)顯著下調(diào)脂肪酸合成相關(guān)蛋白FASN和ACC1的表達(dá)水平,而脂肪酸氧化相關(guān)蛋白ACOX1和ACSL1的表達(dá)水平無(wú)顯著變化。

參考文獻(xiàn)

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