背景^[1-7]

人源化單克隆抗體開發(fā)主要指鼠源單克隆抗體以基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達(dá)的抗體，其大部分氨基酸序列為人源序列取代，基本保留親本鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了其異源性，有利應(yīng)用于人體。由于目前臨床上使用的單抗多數(shù)為鼠源性單抗，容易產(chǎn)生HAMA反應(yīng)（人抗鼠抗體反應(yīng)），存在一定風(fēng)險(xiǎn)，這使得鼠源單抗在臨床治療中的應(yīng)用受到很大的限制。

抗體人源化已成為將鼠源抗體轉(zhuǎn)化為有效安全的治療藥物的重要方式，人源抗體藥物開發(fā)也成為各大藥企爭相研發(fā)的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體的實(shí)驗(yàn)原理是：在抗體生成過程不是從普通小鼠開始，而是從鼠抗體生成基因被相應(yīng)人基因所取代的小鼠開始。該方法要求人的抗體基因片段在小鼠體內(nèi)必須進(jìn)行較為有效的重排與表達(dá)，并且這些片段能與小鼠細(xì)胞的免疫系統(tǒng)信號機(jī)制相互作用，使得小鼠在受抗原刺激后，這些人抗基因片段能被選擇，表達(dá)并活化B細(xì)胞分泌人抗體。

其基本方法是采用在鼠胚胎干細(xì)胞（ES）中的同源重組來使得鼠原有基因缺失，再通過顯微注射等技術(shù)將重建的人源抗體胚系基因微位點(diǎn)轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，最終由mAb的雜交瘤分泌出全人序列的抗體。該方法的特點(diǎn)是外源基因的導(dǎo)入整合效率較高，不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因，目的基因的長度可達(dá)200kb，較少產(chǎn)生嵌合體等。它可以直接獲得純系，所以實(shí)驗(yàn)周期短。然而該方法有一些缺點(diǎn)使其很難在大動(dòng)物中廣泛應(yīng)用：

(1)顯微操作儀器昂貴；

(2) 技術(shù)操作復(fù)雜，要求經(jīng)過專門訓(xùn)練的技術(shù)人員操作儀器；

(3) 顯微注射導(dǎo)入的外源基因在基因組中隨機(jī)整合，可能導(dǎo)致內(nèi)源性功能基因突變或者激活一些致癌基因，無法調(diào)控外源基因在基因組中的整合數(shù)目(拷貝數(shù))

(4)外源基因整合效率較低，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物成本較高；

(5)只能實(shí)現(xiàn)目的基因的整合，不能進(jìn)行基因敲除研究。盡管如此，在體細(xì)胞核移植技術(shù)出現(xiàn)前，顯微注射法是被廣泛使用和效果的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體的主要優(yōu)點(diǎn)是，其功效要優(yōu)于其他生產(chǎn)抗正常人體蛋白mAb技術(shù)。小鼠識別抗原和動(dòng)員抗該抗原的抗體系統(tǒng)仍保持完整，容易把人體蛋白識別為異物。而且，由于抗體是在體內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)歷正常裝配和成熟過程，從而保證成品具有較高的靶結(jié)合親和力。

另一方面，用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)候選mAb藥物時(shí)間較短，費(fèi)用較低。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)目前主要存在以下幾個(gè)問題。一是免疫耐受的問題，雖然可以通過免疫佐劑的使用和免疫方法的改進(jìn)來提高免疫反應(yīng)強(qiáng)度，但對于一些人類抗原仍然較難獲得高親和力抗體；二是上述提到的存在鼠源抗體干擾的問題；三是存在對毒性抗原較難進(jìn)行免疫等問題。

應(yīng)用^[8][9]

人源化單克隆抗體開發(fā)可用于抗腫瘤作用的藥效學(xué)研究：

在重組抗HER2人源化單克隆抗體抗腫瘤作用的藥效學(xué)研究中利用MTT試驗(yàn)法分別檢測受試藥在體外各暴露濃度對不同HER2表達(dá)量的人乳腺癌細(xì)胞以及人胃癌細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)與陽性藥物赫賽汀的生長抑制作用。

用ORIGIN50軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與細(xì)胞生長曲線的繪制,得出半效抑制濃度(IC50,μg·ml-1)和實(shí)測抑制率(Imax,%),進(jìn)行比較。復(fù)蘇擴(kuò)增相關(guān)細(xì)胞,消化收集腫瘤細(xì)胞,按照每只裸鼠接種一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞于裸鼠皮下,建立裸鼠移植瘤模型。按腫瘤體積隨機(jī)將裸鼠分組并開始給藥,給藥途徑為尾靜脈注射。每2-3天測量裸鼠體重并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑數(shù)據(jù),給藥后觀察2周左右,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),頸部脫臼處死動(dòng)物,剝離取出瘤塊稱重,拍照,依據(jù)腫瘤瘤重和相對體積的變化評價(jià)藥物療效。

最后,通過免疫組織化學(xué)染色法檢測MCF-7、MDA-MB-231、MS-1、BT474、Bcap37、MS-1等人乳腺癌細(xì)胞以及SGC7901人胃癌細(xì)胞這些受試細(xì)胞膜上的HER2受體表達(dá)情況。重組抗HER2人源化單克隆抗體進(jìn)行了系統(tǒng)的體內(nèi)體外藥效學(xué)評價(jià),評價(jià)結(jié)果顯示該重組抗HER2人源化單克隆抗體對于各類HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的抑制生長作用都非常顯著,與陽性對照藥物赫賽汀、紫杉醇作用相似。

參考文獻(xiàn)

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