背景^[1-3]

HEK293人胚腎細(xì)胞系也被稱(chēng)為人胚胎腎細(xì)胞293（Human Embryonic Kidney 293），它是一種永生化細(xì)胞系，衍生自人胚胎腎臟。這些細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高，易于培養(yǎng)等特點(diǎn)。HEK293細(xì)胞系是由荷蘭生物學(xué)家Alex van der Eb在1973年從人類(lèi)腎臟細(xì)胞中首次分離出來(lái)的。這些細(xì)胞是在女性胎兒的組織培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的。后來(lái)，Van der Eb實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員Frank Graham對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了剪切的人類(lèi)腺病毒5型DNA轉(zhuǎn)染，使其能夠非常有效地產(chǎn)生大量重組蛋白。因此，該細(xì)胞系被命名為HEK293，以紀(jì)念這次實(shí)驗(yàn)是Frank Graham的第293次實(shí)驗(yàn)。

HEK293人胚腎細(xì)胞系

HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)HEK293人胚腎細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

HEK293人胚腎細(xì)胞系可以用于氧化應(yīng)激在氫醌致人胚腎細(xì)胞HEK293 DNA損傷中的作用

氫醌(1,4-dihydroxybenzene,HQ)是一種重要的工業(yè)化學(xué)品,可作為攝影工業(yè)的顯影劑,橡膠工業(yè)的抗氧化劑,食品的抗氧化劑生產(chǎn)中間體,并作為聚合乙烯和丙烯酸為單體抑制劑。日常生活中通過(guò)某些藥物、化妝品也可長(zhǎng)時(shí)間接觸。HQ是苯的代謝物,在苯毒性效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。HQ主要在肝內(nèi)代謝,經(jīng)尿排出而解毒；部分富集于骨髓組織,進(jìn)一步代謝生成對(duì)苯醌和對(duì)苯半醌。人群流行病調(diào)查及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究均發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期接觸HQ可對(duì)肝、腎、骨髓造血造成損傷。1999年,國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)就將HQ歸為第三類(lèi)致癌物,即現(xiàn)有證據(jù)尚不能就其對(duì)人類(lèi)致癌性進(jìn)行分類(lèi)。體外實(shí)驗(yàn)表明,HQ可引起染色體突變。

研究選用HEK293細(xì)胞作為試驗(yàn)系統(tǒng),探討HQ的DNA損傷作用及可能機(jī)制,旨在為評(píng)估HQ對(duì)人類(lèi)健康的危害提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

方法：試驗(yàn)系統(tǒng)為HEK293人胚腎細(xì)胞系。通過(guò)改良的單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷情況。通過(guò)羅丹明123(Rh123)和吖啶橙(AO)分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位和溶酶體膜穩(wěn)定性；通過(guò)2’,7’—二氫二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)和苯二醛(OPT)分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及還原型谷胱甘肽(GSH)水平。用免疫組化方法測(cè)定8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。為探討其可能的氧化性機(jī)制,采用DL—甲硫氨酸磺酰亞胺(BSO)和抗氧化物質(zhì)羥基酪醇(HT)干預(yù)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平及線粒體膜電位對(duì)HQ所致DNA損傷效應(yīng)的影響。

結(jié)果：HQ(3.125,6.25,12.5μM)作用于細(xì)胞后,DNA的遷移距離明顯增加,且呈劑量依賴關(guān)系；作用于HEK293細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性的破壞和線粒體膜電位的下降,也可使細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平的明顯增加及GSH的耗竭；明顯增加HEK293人胚腎細(xì)胞系內(nèi)8-OHdG水平。HT能夠拮抗HQ引起的DNA鏈斷裂的形成；BSO能夠加劇HQ引起的DNA鏈斷裂的損傷。

結(jié)論：HQ可致HEK293人胚腎細(xì)胞系DNA損傷,其作用機(jī)制可能是通過(guò)線粒體膜電位的下降,溶酶體膜破壞,細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增高及GSH的耗竭,進(jìn)而導(dǎo)致氧化性DNA損傷。

參考文獻(xiàn)

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