【背景及概述】[1][2][3]
維生素B12又稱鈷胺素，B 族維生素之一，主要存在于動物性食品，如內臟、肝、腎和豬心等，瘦肉、魚、牛乳以及蛋黃也存在維生素B12 ；植物中不含維生素B12 ，放線菌、人和動物的腸道菌能合成維生素B12 ，結構上是一類含的復雜有機化合物，所含的三價鈷位于類似卟啉的咕啉環(huán)平面的中心。自然界中的維生素B12有五種左右的類似物，主要是分子中與Co 連接的基團不同，分別為-CN 、-OH、-CH3 、-NO2 和H2O ，它們具有相同的生理活性。
維生素B12以輔酶形式參與各種代謝過程，促進甲基的形成和轉移，參與某些化合物的異構化作用、維持SH 基的還原狀態(tài)，促進DNA 和蛋白質的合成，促進細胞的成熟，維持神經組織的正常功能，缺乏維生素B12時會發(fā)生惡性貧血、神經系統(tǒng)的損害等，臨床上可用于治療惡性貧血、肝臟疾病、神經炎、神經痛等，在飼料工業(yè)上，也用于促進豬、雞等牲畜的生長。維生素B12作為一種人體和動物必需的維生素，其獨特的功能性及其復雜的結構和產生條件決定了其較為苛刻的生產條件，正是這種不易獲得性使其價格非常昂貴，目前國際市場的報價為：97 %的維生素B12的價格為4 ，5000RMB/Kg 。多年來，人們一直在嘗試通過化學成的途徑來降低維生素B12的成本，但由于其龐大而復雜的結構，雖在近些年已獲得成功，但同時使化學家們陷入了新的困境：副產物太多，難以提純。于是，人們又重新審視維生素B12的生產方法，再次將重點轉向發(fā)酵法生產，能產生維生素B12的菌種較多，但由于其作為次級代謝產物，始終在發(fā)酵水平沒有新的突破，在國內，僅近年才出現(xiàn)了兩個生產廠家，但其年產量總共不足兩噸，與龐大的國內需求市場微不足道，目前國內市場上食用及藥用維生素B12的90 %以上依靠進口，因此，在國內實現(xiàn)維生素B12的低成本化，將會有巨大的市場潛力。
【理化性質及結構】[1]
維生素B12為深紅色結晶體，熔點甚高(320 ℃時不熔)，無臭無味，溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯仿、丙酮和乙醚，結構性質相當穩(wěn)定；在中性溶液中耐熱、酸、堿，日光、氧化劑和還原劑均能使其破壞。
【制劑規(guī)格】[4]
注射劑：1mL∶50μg；1mL∶100μg；1mL∶250μg；1mL∶500μg；1mL∶1000μg。 pH(100～1000μg/mL)：3.5～5.5。
【藥理作用及應用】[4]
抗貧血藥。用于巨幼細胞性貧血，也可用于神經炎的輔助治療。
【用法用量】[4]
肌注，治療維生素B12缺乏癥，起始一日25～100μg 或隔日50～200μg，共2周；如伴有神經系統(tǒng)表現(xiàn)，一日用量可增加至500μg。以后每周肌注2次，每次50～100μg，直到血象恢復正常；維持量每月肌注100μg。亦可做深部皮注。
【不良反應】[4]
偶可引起皮疹、瘙癢、腹瀉及過敏性哮喘，極個別有過敏性休克；可引起低血鉀及高尿酸血癥。維生素B12靜注曾有致死報道。
【禁忌/慎用證】[4]
對本藥過敏、家庭遺傳性球后視神經炎及抽煙性弱視癥者禁用。
【注意事項】[4]
1. 靜脈給藥后會迅速從尿排出，且有致死案例故禁忌靜脈給藥；
2. 大劑量維生素B12治療巨幼細胞性貧血，在起始48h 宜查血鉀有無下降；
3. 抗生素可影響血清和紅細胞內維生素B12 測定，特別是應用微生物學檢查方法，可產生假性低值。
【制備】[1][2]
1. 生產菌種：
2.生物合成：
3. 發(fā)酵生產：
1）抗生素廢液中提?。涸缭?952 年美國T .R.Wood 等人就發(fā)現(xiàn)，當用加有鈷化合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)灰色鏈霉菌時，可大大提高維生素B12在整個培養(yǎng)液中的濃度，但是對于鈷化合物的濃度要求要適量，過高的濃度會對菌體細胞產生毒性；另有研究表明，添加適量的氰化合物也同樣可促進抗生素廢液中B12 類似物的含量，但需嚴格掌握其用量。
2）放線菌發(fā)酵：自從人們發(fā)現(xiàn)可從抗生素廢液中提取得到維生素B12后，許多科學家將目光轉向了采用放線菌，其中主要是鏈霉菌屬中的灰色鏈霉菌和橄欖色鏈霉菌來發(fā)酵產維生素B12 ，而于鏈霉素的生成，而始終未能使得維生素B12的產生處于主導地位，因此，應選出鏈霉素發(fā)酵支路的關鍵酶，并將其抑制，這樣便可大大提高維生素B12的得率，使得大量產生維生素B12成為可能。
3）下水道廢液中提?。翰捎蒙锘钚晕勰喾ㄌ幚淼膹U水中，通常含有多的B12，干的活性污泥可先用水浸提，然后過濾掉固形顆粒，之后可分離、純化B12，由此得到的B12有如下特點：無需前培養(yǎng)，這樣大大減少了前期投入；能耗大，尤其是濃縮這一關鍵性步驟將造成大的能量損耗；用此法得到的B12的濃度雖并不低，但受活性污泥這一來源的影響，由此獲得的B12并不能直接進入食品或藥品級產品，而通常只局限于飼料添加劑。
4）丙酸菌發(fā)酵：丙酸菌，例如Propionibacterium freudenreichii 和Propionibacteriumshermanii 常用作B12 的產生菌，這類細菌常采用厭氧發(fā)酵，采用丙酸菌發(fā)酵的特點：在于培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中，產生丙酸菌而使得培養(yǎng)基PH 下降，從而可避免雜菌的污染；因為是厭氧發(fā)酵，勿需設計供氧系統(tǒng)和攪拌系統(tǒng)，可減少設備投入和節(jié)約能耗；隨著發(fā)酵過程丙酸鈣的產生，而丙酸鈣通常是用作防霉和防腐添加劑的，從而可進一步減少染菌的可能性。
5）由巨大芽孢桿菌生產B12：以巨大芽孢桿菌為例，將培養(yǎng)基用氨水調至pH7 .0，發(fā)酵液需要連續(xù)不停地攪拌和大量通氣，溫度需控制在30 ℃左右，每隔一定時間需用5 %的氨水來調pH，同時需定期補充碳、氮源，以期達到最高產量。
6）采用轉基因的E .Coli .發(fā)酵生產：目前，人們對于B12的控制基因已經非常清楚，因此，這就使得將其轉入大腸桿菌，以期大量生產，但該方法真正用于大生產還有待時日，即使用于生產，也會不可避免地存在這樣的問題，如導入的質粒不能穩(wěn)定地遺傳下去，會隨發(fā)酵條件的變化而脫落等，因此，就近些年，維生素B12 的生產仍需按傳統(tǒng)發(fā)酵來完成。
【測定】[1][2]
1. 比色測定法
本法是藥物樣品中維生素B12 測定的常用方法。其原理是樣品經濃硫酸和高氯酸鉀消化后，樣液中的鈷與M -二-(α-吡啶酮)-α-吡啶聯(lián)腙生成鈷的紅色化合物，可以進行比色測定，再從鈷的含量換算成維生素B12的含量。
2. 離子交換測定法
藥物中的維生素B12可以從弱酸性陽離子交換樹脂中得到，分離洗脫下來。例如，桔子醬中的維生素B12通過Florisi 土為吸咐劑進行層析分離后，在530nm 波長處測定其含量。
3. 原子吸收法
維生素B12的分子中含有鈷原子，占維生素B12的4 .35 %，采用原子吸收分光光度法可以測定其中的鈷含量，再換算成維生素B12 含量。在測定藥品中維生素B12時，可以直接將藥品的溶液吸入原子分光光度計中測定。但用于測定食品中的維生素B12時，先將樣品預先處理，樣品用提取劑提取，于濾液中加入5 .0g EDTA ，用NH4OH 調節(jié)至pH7 .0 ，再加入5g 活性炭，振搖，用無灰濾紙過濾，維生素B12被吸附在活性炭上，將活性炭連同濾紙一起在600 ℃下灰化完全，用5mol/L 的硝酸將殘渣溶解，然后用原子吸收分光光度法測定鈷的含量，本法與微生物法結果一致。
4. 微生物法
原理同微生物學濁度法，試驗菌種采用乳酸酐菌Leichmannii(ATCC 7830)，靈敏度>20ng/Kg 。
【主要參考資料】
[1] 羅祎, 郝常明. 維生素 B12 的研究及其進展[J]. 中國食品添加劑, 2002 (3): 15-18.
[2] 謝麗華. 維生素 B12 的技術進展[J]. 河北化工, 2011, 34(1): 23-26.
[3] 張玉明, 王雷, 王云山, 等. 維生素 B12 的生物合成研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(9): 70.
[4] 452種注射劑安全應用與配伍