背景[1-3]
人P53(P53)ELISA KIT采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。
原理：往預(yù)先包被捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
人P53蛋白結(jié)構(gòu)圖
操作步驟
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。
應(yīng)用[4][5]
用于卵巢腫瘤組織中突變型p53表達與iNOS活性及二者相關(guān)性的研究
收集病理存檔標(biāo)本75例，其中因手術(shù)切除正常卵巢11例，卵巢良性腫瘤15例，惡性腫瘤49例，根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)將卵巢惡性腫瘤分為：早中期（Ⅰ、Ⅱ期）20例，晚期（Ⅲ、Ⅳ期）29例；高分化者12例，中低分化者37例，標(biāo)本均經(jīng)4％甲醛固定，石蠟包埋，制成5μm厚切片。
實驗方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測突變型p53、iNOS蛋白的表達情況，即用型SABC試劑盒、兔抗人p53多克隆抗體、兔抗人iNOS多克隆抗體由武漢博士德公司提供，切片脫蠟后，按SABC免疫組化試劑盒步驟進行。
陰性對照用PBS代替一抗，每張切片隨機選取5個視野，得出每張切片iNOS、突變型p53陽性染色細胞百分率，根據(jù)陽性染色細胞率分為3級：m（－）整個切片未見陽性染色或陽性染色細胞數(shù)＜10％；切陽性（十卜陽性染色細胞數(shù)占10％－40％；枯）強陽性(＋十廠3 40％。
統(tǒng)計學(xué)分析采用卡方檢驗及等級秩和檢驗。結(jié)果1、免疫組織化學(xué)結(jié)果：iNOS／l例正常卵巢組織中陽性率為18．18％，15例卵巢良性腫瘤為20．00助，49例惡性腫瘤中為61．22％；突變型自3正常卵巢為9．09％，卵巢良性腫瘤為13．33％，卵巢惡性腫瘤為65．31％。經(jīng)卡方檢驗，iNOS惡性組表達分別與正常卵巢、良性腫瘤組進行比較差異都有顯著意義(P＜0．05人突變型PS 3蛋白在惡性組表達分別與正常卵巢、良性腫瘤組進行比較差異都有顯著意義對＜0．01。
參考文獻
[1] The CpG dinucleotide and human genetic disease[J].David N.Cooper,Hagop Youssoufian.Human Genetics.1988(2)
[2] Emerging strategies to overcome resistance to endocrine therapy for breast cancer[J].M.Firdos Ziauddin,Dong Hua,Shou-Ching Tang.Cancer and Metastasis Reviews.2014(2-3)
[3] Breast cancer in China[J].Lei Fan,Kathrin Strasser-Weippl,Jun-Jie Li,Jessica St Louis,Dianne M Finkelstein,Ke-Da Yu,Wan-Qing Chen,Zhi-Ming Shao,Paul E Goss.Lancet Oncology.2014(7)
[4] Nuclear Receptor Coactivators:Master Regulators of Human Health and Disease[J].Subhamoy Dasgupta,David M.Lonard,Bert W.O’Malley.Annual Review of Medicine.2014
[5]劉凜.卵巢腫瘤組織中突變型p53表達與iNOS活性及二者相關(guān)性的研究[D].中國醫(yī)科大學(xué),2003.