酵母裂解酶-100T來自藤黃節(jié)桿菌（現(xiàn)貨促銷） Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus -----MP Biomedicals New Zealand Limited 簡述： Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通過Arthrobacter luteus(藤黃節(jié)桿菌)深層培養(yǎng)獲得的酶制劑，它能有效的裂解活酵母細(xì)胞細(xì)胞壁。該制劑是利用親和層析法部分純化獲得的凍干酶，其酶活單位是100,000 單位/g.其中主要負(fù)責(zé)裂解活酵母細(xì)胞的酶成分是?-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通過對?-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物，釋放產(chǎn)物主要是昆布五糖。 產(chǎn)品說明： 單位定義：800nm條件下菌液吸光度下降30%，表示一個活力單位。 特異性：此產(chǎn)品的裂解譜包括以下屬的生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others. 用途:可用于細(xì)胞裂解、原生質(zhì)球形成及葡聚糖水解。 說明:酵母細(xì)胞的裂解程度隨酵母菌的種類、生長階段及培養(yǎng)條件而改變。 聲明: Zymolyase是麒麟麥酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注冊商標(biāo)。 儲存:凍干狀態(tài)于2-8°C中保存，若30°C下放置3個月約失去90%活力。 外觀:凍干粉 活力：100,000單位/g 核心酶：?-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶 其他酶: ?-1,3-葡聚糖酶，約1.0 x 107 單位 /g 蛋白酶，約1.7 x 104單位 /g 甘露聚糖酶, 約6.0 x 104單位 /g 淀粉酶，木聚糖酶，***酶，微量DNase及Rnase（未檢出） 催化劑：二硫蘇糖醇（DTT）, ?-巰基乙醇及其他的巰基化合物（如半胱氨酸） 最適pH及溫度： pH 7.5, 35°C裂解活酵母細(xì)胞 pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖 pH范圍：pH 5-10間保持穩(wěn)定 熱穩(wěn)定性：60°C，5min喪失細(xì)胞溶解能力 警告：（1）Zymolase?-100T溶解度低，以懸浮液的狀態(tài)使用。如果需制備濃度超過0.05%的無菌酶溶液，則通過將Zymolase?-100T溶解在含5%葡萄糖的緩沖液中（pH 7.5），首先配制2%的酶儲存液；（2）吸取懸浮液，留下沉至容器管底的任何物質(zhì)；（3）不推薦使用**纖維過濾器；（4）稀釋無菌的酶懸浮液至目標(biāo)濃度。 原生質(zhì)球制備程序： 1. 室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養(yǎng)物； 2. 收集離心沉淀物（酵母細(xì)胞）并記錄濕重； 3. 用TE緩沖液懸浮細(xì)胞，加入量為1.4ml/g濕重細(xì)胞；（TE緩沖液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]） 4. 雙蒸水快速定容，終體積量為3.5ml/g濕重細(xì)胞； 5. 按照17.5 ul (總體積的1/200)/ g濕重細(xì)胞的量加入? -巰基乙醇（MP 806445），目的是為了除去細(xì)胞外層中的甘露聚糖層； 6. 30°C輕搖溫育混合液，處于對數(shù)期生長的培養(yǎng)物處理15min，處于穩(wěn)定期生長的培養(yǎng)物處理45min； 7. 室溫條件，5000rpm離心5min； 8. 用S緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加入量為4.0ml/g濕重細(xì)胞；（S緩沖液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5） 9. 5000rpm離心5min； 10. 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細(xì)胞）懸浮細(xì)胞，另外加入Zymolyases（50U /g濕重細(xì)胞）；如果Zymolyases配制成附錄所示的溶液，則添加250ul即可。根據(jù)實驗情況最先優(yōu)化酶使用量。 11. 30°C輕搖溫育混合液30min，根據(jù)以下方式監(jiān)測原生質(zhì)球形成程度： （1） 加1ul樣品到20ul S 緩沖液內(nèi)，原生質(zhì)球應(yīng)該保持完整； （2） 加1ul樣品到20ul雙蒸水中，原生質(zhì)球應(yīng)該破裂；顯微鏡下觀察比較兩個樣品的形態(tài)差異。 12．一般情況下反應(yīng)45-60min，原生質(zhì)球的形成量>90%，此時4oC下離心收集細(xì)胞，5000rpm，5min； 13. 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細(xì)胞）懸浮原生質(zhì)球，5000rpm離心5min；重復(fù)此步驟做第二次清洗；； 14.原生質(zhì)球離心沉淀物-70oC凍存。 裂解原生質(zhì)球獲取細(xì)胞核： 溫和的裂解原生質(zhì)球方法如下; 用3倍體積的18%Ficoll（MP 160003）溶液懸浮細(xì)胞離心沉淀物，F(xiàn)icoll溶解于含有0.5 mM CaCl2 (MP 195088)的10 mM PIPES 緩沖液內(nèi)，pH 6.5。 酵母菌基因組DNA的制備： 以下步驟快捷，適合于從少量酵母培養(yǎng)物中制備基因組DNA ： 1. 將過夜培養(yǎng)的10ml酵母菌培養(yǎng)物離心收集細(xì)胞，加入280ul TE Buffer（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟3），300 ul雙蒸水，3 ul ? -巰基乙醇（MP 806445）； 2. 30oC溫育45min； 3. 以臺式離心機的最高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀物用500 ul S 緩沖液（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟8）懸浮.；再次離心棄上清； 4. 用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S緩沖液懸浮細(xì)胞沉淀物（或者使用自己認(rèn)為最合適的酶濃度）； 5. 30oC溫育1小時； 6. 重復(fù)步驟3； 7. 用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 緩沖液懸浮細(xì)胞沉淀物； 8. 37oC溫育3小時，不時的混勻溶液； 9. 調(diào)水浴鍋的溫度至65oC，并溫育20min； 10. 從水浴鍋內(nèi)取出并冷卻至室溫； 11. 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機內(nèi)取出并保留上清液； 12. 用200ul氯仿萃取上清液，之后重復(fù)漩渦混勻及離心； 13. 加入500ul95%乙醇到上清液內(nèi)，20oC沉淀10min； 14. 4oC下，15,000 xg離心20 min； 15. 自然風(fēng)干或者于真空離心蒸發(fā)濃縮器內(nèi)晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076)）溶解DNA; 16. 37oC溫育1小時； 17. 重復(fù)步驟11和12； 18. 加入2.5倍體積的95%乙醇，20oC沉淀10min； 19. 30ul雙蒸水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A260，根據(jù)消光系數(shù)計算DNA產(chǎn)量； 20. 產(chǎn)量大約為40-50ug。 附錄: 制備Zymolyase 100T溶液： 以下配制的溶液適用于該產(chǎn)品的實驗程序中（但并不排除其他類型的母液也適用） 配制200單位/ml的母液，將凍干粉溶于已高壓滅菌的S緩沖液（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟8）。 如果不被微生物污染，于4 oC下，此母液能2個星期以上時間內(nèi)保持高效； 參考文獻(xiàn)： 1. 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