RNAeasy™動物小RNA抽提試劑盒(離心柱式)

信裕生物的離心柱式RNAeasy™小RNA抽提試劑盒(RNAeasy™ Small RNA Isolation Kit with Spin Column)，也稱離心柱式miRNA抽提試劑盒(miRNA Isolation Kit with Spin Column)，是一種基于離心柱法從動物組織或培養(yǎng)的動物細(xì)胞中安全、快速、便捷、穩(wěn)定、高效、高質(zhì)量地抽提miRNA等小于200個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)的小RNA(small RNA)的試劑盒。
本試劑盒抽提得到的小RNA可用于反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、qPCR、Northern等常規(guī)實(shí)驗(yàn)，也可以用于基因芯片分析
(microarray)、高通量測序(high throughput sequencing)等對小RNA質(zhì)量要求較高的情況。
信裕生物的三款離心柱式及Trizol法RNA抽提試劑盒的主要特點(diǎn)和差異如下：

動物組織或細(xì)胞中的RNA按照長度可以分為長鏈RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，長鏈RNA通常大于200nt(也常被稱為總RNA)，而小RNA通常小于200nt。長鏈RNA按照是否編碼蛋白或多肽可以分為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非編碼的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。
本試劑盒抽提小RNA的基本流程如圖1所示。樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA，然后在兩次高速離心過程中，通過離心柱將不同大小的RNA分離。次過柱時(shí)，200nt以上的RNA特異性結(jié)合到純化柱上，而200nt以下的小RNA穿柱而過被收集到液體收集管中；第二次過柱時(shí)，特定的結(jié)合體系使小RNA結(jié)合到另一個(gè)純化柱上。然后通過2次洗滌充分去除非特異性結(jié)合的蛋白、鹽等雜質(zhì)，最后用洗脫液將高純度的小RNA洗脫下來。

圖1. 離心柱式小RNA抽提流程示意圖

本試劑盒使用安全。本試劑盒通過特殊的柱純化介質(zhì)進(jìn)行小RNA分離純化，不僅能有效避免傳統(tǒng)的Trizol法抽提時(shí)使用的酚、氯仿等有毒有害有機(jī)試劑，也能有效避免如國外知名的Q品牌等公司使用類似于Trizol的裂解液裂解樣品、接著使用氯仿分層、后續(xù)再進(jìn)行柱純化等涉及的有毒有害有機(jī)試劑。
本試劑盒使用快速、便捷。本試劑盒采用柱純化，無需繁瑣的RNA沉淀步驟，抽提操作過程僅20-25分鐘。相比于傳統(tǒng)的Trizol抽提法，本試劑盒能夠有效去除大分子RNA，操作流程顯著簡化，縮短了抽提時(shí)間，降低了RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。和國外同類柱純化產(chǎn)品相比，所需操作步驟和操作時(shí)間基本一致。
本試劑盒抽提獲得的小分子量RNA得率高、純度好。100萬培養(yǎng)動物細(xì)胞約能抽提得到1-2μg小RNA，5mg小鼠肝臟組織約能抽提得到1-1.5μg小RNA。A260/A280通常為2.0-2.2。本試劑盒與國際知名T品牌同類產(chǎn)品的抽提效果對比圖參見
      本試劑盒與T品牌同類產(chǎn)品的小RNA抽提效果對比。樣品為凍存的100萬個(gè)HeLa細(xì)胞、5mg小鼠肝組織和5mg小鼠腎組織。洗脫液用量均為30μl。均取6μl洗脫的樣品經(jīng)變性處理后，在含7M尿素的15% TBE-PAGE中電泳約90分鐘后在NA-Red溶液中染色后拍照。信裕生物試劑盒抽提產(chǎn)物的A260/A280依次為2.01、2.07和2.06；T品牌試劑盒抽提產(chǎn)物的A260/A280依次為1.93、1.79和1.29。實(shí)際抽提效果會因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器等的不同而存在差異，本圖僅供參考。

本試劑盒用于抽提18-200 nt小RNA，主要包括5.8S rRNA、5S rRNA、tRNA、microRNA (miRNA)，以及short
interfering RNA (siRNA)、piRNA、tsRNA等，能夠有效去除基因組DNA和200nt以上的RNA，如28S rRNA、18S rRNA、mRNA等。
本試劑盒適用于新鮮或凍存的動物組織或細(xì)胞樣品小RNA的抽提。樣品的用量對抽提效果影響較大，樣品用量過多會導(dǎo)致在次過柱時(shí)不能程度去除200nt以上的RNA，通常建議培養(yǎng)細(xì)胞的用量不超過100萬，動物組織的用量不超過5mg。
本試劑盒可用于50個(gè)樣品的小RNA抽提。
包裝清單：

保存條件：
      室溫保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
      對于富含RNase的樣品(如動物組織)，建議使用前在裂解液中添加二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)至終濃度為40mM (例如1ml裂解液中加入20μl 2M DTT)或β-巰基乙醇至終濃度為1% (如1ml裂解液中加入10μl β-巰基乙醇)，含DTT或β-巰基乙醇的裂解液可在室溫放置1個(gè)月。
      本試劑盒提供的所有試劑和耗材都是RNase-free，操作時(shí)應(yīng)小心，避免被污染。所有自行準(zhǔn)備的試劑和耗材也都應(yīng)是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后高溫高壓滅菌并烘干。操作時(shí)應(yīng)避免對著樣品或所使用的試劑盒耗材呼氣或說話，以防RNase污染。建議戴一次性口罩操作。
      對于操作環(huán)境中RNA酶的去除，推薦使用信裕生物生產(chǎn)的RNase and DNase Away (R0123)以去除實(shí)驗(yàn)桌面上或其它接觸面上的RNase。
      使用凍存的細(xì)胞或組織抽提小RNA的效果通常比新鮮的細(xì)胞或組織差一些。因?yàn)樵诩?xì)胞或組織凍融過程中一些細(xì)胞或組織內(nèi)的RNase會被釋放出來并剪切樣品中的RNA。對于組織樣品，推薦使用信裕生物生產(chǎn)的RNALater™動物組織RNA穩(wěn)定保存液(R0118)進(jìn)行保存以保證樣品RNA的完整性。 
      本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時(shí)無需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。 
      廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。 
      結(jié)合液I、結(jié)合液II和洗滌液中含有乙醇，使用后須旋緊瓶蓋以防揮發(fā)，并須按照易燃試劑的相關(guān)規(guī)范進(jìn)行存放和使用。 
      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。 
      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備。
細(xì)胞樣品：收集50-100萬左右的細(xì)胞。對于懸浮細(xì)胞，1000-2000g離心1分鐘后棄上清，加入300μl裂解液，輕輕吹打8-10次至固懸物溶解、溶液澄清；對于貼壁細(xì)胞，吸凈培養(yǎng)液后加入300μl裂解液，輕輕吹打5-10次至固懸物溶解、溶液澄清，轉(zhuǎn)移至一潔凈離心管內(nèi)。
組織樣品：取5mg動物組織，置于液氮中研磨成粉末，立即加入300μl裂解液。也可將組織置于1.5ml離心管中，迅速加入300μl裂解液，用微型電動勻漿器勻漿，或者用普通玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿。研磨或勻漿后，輕輕吹打勻漿液8-10次，室溫放置3-5分鐘。然后約14,000g離心2分鐘，將上清液移至新的離心管中。對于比較容易裂解且勻漿很充分的組織(如肝組織、腦組織等)可以不用高速離心而直接進(jìn)入步驟2。
注意：細(xì)胞的數(shù)量不超過100萬，動物組織的用量不超過5mg，細(xì)胞或組織用量過多會導(dǎo)致大分子RNA不能去除完全。對于富含RNase的樣品，裂解液中宜添加DTT至終濃度為40mM或添加β-巰基乙醇至終濃度為1%。
2.加入300μl結(jié)合液I至裂解液中，輕輕顛倒混勻3-5次。此時(shí)可能會有沉淀物產(chǎn)生，屬于正常現(xiàn)象。
3. 將混合物(包括沉淀物)轉(zhuǎn)移至第1個(gè)純化柱內(nèi)，12,000g離心30秒，回收收集管內(nèi)液體至一新的1.5ml離心管。 
注意：對于一些非常特殊的樣品，如出現(xiàn)溶液未完全通過時(shí)，可延長離心時(shí)間至1-2分鐘，或者加大離心力至16,000g。對于一些能快速啟動達(dá)到12,000g的離心機(jī)，離心30秒已經(jīng)足夠，對于一些啟動速度緩慢的離心機(jī)本步驟及后續(xù)步驟中的30秒離心宜調(diào)整為60秒。
4.向溶液中加入700μl結(jié)合液II，混勻后，將混合物(包括沉淀物)分兩次轉(zhuǎn)移至第2個(gè)純化柱內(nèi)，每次12,000g離心30秒后倒棄收集管內(nèi)液體。
注意：加入結(jié)合液II后溶液總體積超過純化柱的容量(約750μl)，因此須分成2次過柱，即將一半的混合物(約650μl)加入純化柱內(nèi)后12000g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體，再將剩余的混合物加入純化柱內(nèi)12000g離心30秒，并倒棄收集管內(nèi)液體。
5.加入600μl洗滌液，12,000g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
6.重復(fù)步驟5一次。
7.最高速(約14,000-16,000g)離心2分鐘，去除殘留液體。
8.將RNA純化柱置于一新的1.5ml離心管上，加入30-50μl洗脫液，室溫放置2-3分鐘，最高速離心30秒，所得溶液即為純化的小RNA。 
注意：洗脫液需要加到純化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需獲得更高濃度的樣品，可把洗脫液的體積減小至20ul，但洗脫下來的總RNA量會相對減少。室溫較低時(shí)，洗脫液在37℃預(yù)熱片刻對得率有所幫助。此外，洗脫后的溶液再次加回到原純化柱再離心洗脫一次，可提高得率約10-30%；或者在次洗脫后使用新的洗脫液再洗脫一次，會獲得約為次洗脫量10-35%的小RNA。