BeyoAP Alkaline Phosphatase

BeyoAP Alkaline Phosphatase，即BeyoAP堿性磷酸酶，是一種熱敏感的，可以催化DNA、RNA、核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸水解釋放5′或3′末端磷酸基團(tuán)的酶，也可以脫去蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)。BeyoAP Alkaline 
Phosphatase是一種新型堿性磷酸酯酶，在信裕生物的各種內(nèi)切酶和PCR緩沖液中可保持100%活性，對(duì)于各種類型的DNA 5′末端的去磷酸化均可在37℃孵育10分鐘即可完成，并且75℃孵育5分鐘即可完全失活。
堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP/ALP/AKP/ALKP/ALPase/Alk Phos)常被稱作堿性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)，是一類水解酶，通過(guò)水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，其去磷酸化作用的底物包括核苷酸、蛋白質(zhì)和生物堿等，并在堿性條件下最為有效。該酶是一組同功酶的統(tǒng)稱。常見的小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline
Phosphatase, CIAP/CIP)被廣泛用于二抗等的標(biāo)記最終用于蛋白和核酸等的檢測(cè)，也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去單磷酸化)，特別是質(zhì)粒的5'末端去磷酸化以避免質(zhì)粒自連等。
經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒5′端帶有磷酸基團(tuán)，在進(jìn)行基因克隆時(shí)為避免質(zhì)粒自連，可以使用BeyoAP Alkaline
Phosphatase去除5′末端磷酸基團(tuán)。脫去5′末端磷酸基團(tuán)的質(zhì)粒不能發(fā)生自連。
特點(diǎn)：快速去磷酸化，只需37℃孵育10分鐘即可；快速失活，75℃孵育5分鐘即可完全失活；使用方便，在各種內(nèi)切酶和PCR緩沖液中保持100%活性，可以和質(zhì)粒DNA的消化同時(shí)進(jìn)行；操作步驟簡(jiǎn)單，對(duì)于5′或3′突出末端、平端等各種DNA的脫磷酸化采用完全相同的操作步驟；可直接用于連接反應(yīng)，經(jīng)BeyoAP Alkaline Phosphatase脫磷，并75℃孵育5分鐘失活后可直接用于后續(xù)的連接反應(yīng)。
用途：通過(guò)去除載體或DNA片段5′末端的磷酸基團(tuán)，防止載體或DNA片段自連；質(zhì)粒DNA的同時(shí)內(nèi)切酶消化和脫磷；通過(guò)5′末端脫磷，為5′末端磷酸化放射性標(biāo)記準(zhǔn)備模板；去除DNA、RNA 5′或3′末端的磷酸基團(tuán)；用于蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的去磷酸化。
來(lái)源：大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)基因?yàn)橐环N細(xì)菌堿性磷酸酯酶基因。
酶活性定義：37℃10分鐘內(nèi)，催化1μg 線性化的pUC19 DNA5′末端脫磷所需的酶量定義為一個(gè)活力單位。
純度：不含DNA外切酶和內(nèi)切酶，不含RNA酶。
酶儲(chǔ)存溶液：20mM HEPES-NaOH(pH7.4)，1mM MgCl₂，0.1mM ZnCl₂，0.1% Triton X-100，
50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：100mM Tris-HCl(pH8.0 at 37℃)，50mM MgCl₂，1M KCl，0.2% Triton X-100，10mM 2-mercaptoethanol，1mg/ml BSA。
失活或抑制：75℃加熱5分鐘可以使BeyoAP Alkaline Phosphatase失活。金屬離子螯合劑對(duì)BeyoAP Alkaline
Phosphatase有抑制作用。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)： 
酶使用時(shí)宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后宜立即放置于-20℃保存。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 

使用說(shuō)明：
1. 質(zhì)粒DNA同時(shí)進(jìn)行內(nèi)切酶消化和5′末端脫磷：
a. 參考如下表格設(shè)置去磷酸化反應(yīng)：

b. 按上述體系配好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 37℃孵育60分鐘。注意：如果質(zhì)粒DNA消化和脫磷后用于后續(xù)的連接反應(yīng)，推薦先參考上表進(jìn)行內(nèi)切酶消化，但不加入BeyoAP Alkaline Phosphatase。內(nèi)切酶消化6-16小時(shí)后，再加入BeyoAP Alkaline Phosphatase 37℃孵育10分鐘。內(nèi)切酶消化時(shí)間比較長(zhǎng)，可以大大減少自連克隆出現(xiàn)的幾率。
d. 75℃加熱5分鐘或根據(jù)內(nèi)切酶失活的其他條件進(jìn)行酶的失活。
e. 后續(xù)可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法純化已消化并且脫磷酸化的DNA，也可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒進(jìn)行純化。DNA純化試劑盒(D0033)可以向信裕生物訂購(gòu)；如果切出的片段大于50bp，通常需要進(jìn)行DNA凝膠電泳和切膠回收。DNA凝膠回收試劑盒(D0056)可以向信裕生物訂購(gòu)。
2. DNA、RNA的5′或3′末端脫磷
a. 參考如下表格設(shè)置去磷酸化反應(yīng)：

b. 按上述體系配好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 37℃孵育10分鐘。
d. 75℃加熱5分鐘失活BeyoAP Alkaline Phosphatase。
e. 后續(xù)可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法純化已消化并且脫磷酸化的DNA，也可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒進(jìn)行純化。DNA純化試劑盒(D0033)可以向信裕生物訂購(gòu)；如果切出的片段大于50bp，通常需要進(jìn)行DNA凝膠電泳和切膠回收。
說(shuō)明：上述脫磷反應(yīng)可以用于5′或3′突出的DNA，也可以用于平末端DNA，反應(yīng)條件相同，即均為37℃孵育10分鐘。
3. 蛋白去磷酸化
a. 參考如下表格設(shè)置去磷酸化反應(yīng)：

b. 按上述體系配好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 37℃孵育60分鐘。
d. 加入EDTA至終濃度為50mM或加入釩酸鈉至終濃度為10mM以終止去磷酸化反應(yīng)。
注意：酶的用量和37℃的孵育時(shí)間需根據(jù)特定蛋白自行進(jìn)行優(yōu)化。
4. 其他用途請(qǐng)參考上述用途或堿性磷酸酶的相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行。