釀酒酵母Y2HGold化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品及特點(diǎn)釀酒酵母 Y2HGold 是 Clontech 公司開發(fā)的 GAL4 系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa 型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與 MATα 型酵母菌株 Y187 通過 mating 操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩 庫試驗(yàn)。Transformation marker 為：trp1，leu2，報(bào)告基因?yàn)椋篈bAr，HIS3，ADE2，MEL1。 Y2HGold-GAL4 酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pGBKT7 和 pGADT7。質(zhì)粒 pGBKT7 的篩選標(biāo)志為 TRP1，用于表達(dá) DNA-BD (來自酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4N 端 1~174 位 氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒 pGADT7 的篩選標(biāo)志為 LEU，用于表達(dá) AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Prey)的融合蛋白。

GAL4 系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu) 域：位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域(DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸 區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS， 并與之結(jié)合。而AD可以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄， 但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常 條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait -BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey發(fā)生相互作用，就會促使BD和AD的相 互接近，形成完整的GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。Y2HGold有四個(gè)報(bào)告基因：AbAr， HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子(G1，G2，M1)啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只 有GAL4識別的17 bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概 率。此外新報(bào)告基因AbAr與以前的營養(yǎng)缺陷報(bào)告基因相比具有更低背景的優(yōu)點(diǎn)，也可以降 低酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。

Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化 效率>104cfu/μg DNA。

Y2Hgold的基因型是：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
規(guī)格及成分 成分 編號 包裝
Y2Hgold 感受態(tài)細(xì)胞 140390A 0.1 mL×10
PGADT7，10 ng/μL 140390B 10 μL
Carrier DNA，5 μg/μL 140390C 100 μL
PEG/LiAc 140390D 5 mL
使用手冊 1 份

運(yùn)輸及保存 感受態(tài)細(xì)胞干冰運(yùn)輸、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效 期半年。

自備試劑 目的 DNA、YPDA、 SD 培養(yǎng)基等

使用方法1. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100 μL，可以根據(jù) 實(shí)際情況分裝使用。 以下實(shí)驗(yàn)以 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞為例。

2. 待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中依次加入 2-5 μg 預(yù)冷的目的質(zhì)粒、10μL Carrier DNA（95-100℃ 5 分鐘，快速冰浴，重復(fù)一次）、500 μL PEG/LiAc， 吹打混勻，30℃水浴 30 分鐘（15 分鐘時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

3. 42℃水浴 15 分鐘（7.5 分鐘時(shí)翻轉(zhuǎn) 6-8 次混勻）。

4. 5000 rpm 離心 40 秒，棄上清。取 400 μL ddH2O 重懸沉淀，5000 rpm 離心 30 秒，棄上清。

5. 取 50 μL ddH2O 重懸沉淀，涂板，29℃培養(yǎng) 48-96 小時(shí)。