ssDNA/RNA 環(huán)化連接酶為熱穩(wěn)定的DNA/RNA連接酶，不依賴于ATP，可催化單鏈DNA或單鏈RNA的環(huán)化，也可催化其分子間連接，但其對(duì)單鏈DNA的連接效率更高。環(huán)化反應(yīng)中，要求催化底物單鏈DNA/RNA具有5’-磷酸基團(tuán)和3’-OH基團(tuán)。對(duì)于大于15nt的單鏈底物，該酶都能高效的連接。該酶還可催化DNA或RNA分子與預(yù)腺苷化的DNA接頭之間的連接，另外，在ATP過量的情況下，該酶可使DNA/RNA分子腺苷化。

組分

組分名稱 數(shù)量
ssDNA/RNA CircLigase (100 U/μl) 20 μl
10×CircLigase Buffer 250 μl
50mM MnCl2 100 μl

活性定義

60°C 1h條件下，催化1pmol 5’-磷酸化參照Oligo (55mer)完全環(huán)化所需的酶量定義為1U。

儲(chǔ)存

-20℃可保存3年。

使用注意事項(xiàng)

1. 1×CircLigase Buffer: 30mM Tris-acetate (pH 7.5), 60mM potassium acetate, 1mM DTT。
2. 添加終濃度50μM的ATP可提高環(huán)化效率，高于1mM ATP濃度會(huì)抑制連接反應(yīng)。
3. 對(duì)于單鏈DNA產(chǎn)物的連接，需要加入終濃度2.5mM MnCl2。
4. 5’端未磷酸化的底物不能用于連接，3’端無-OH的底物不能用于連接。
5. 對(duì)于含有二級(jí)或復(fù)雜結(jié)構(gòu)的連接底物，可加入0.4~0.8 M Betain以提高連接效率。
6. 該酶對(duì)底物堿基具有選擇性，5’末端連接效率: G > A >>> T (U)>>> C，3’末端連接效率T(U) > A > G，當(dāng)3’端的堿基為C時(shí)不能用于連接，幾乎無連接產(chǎn)物。

實(shí)例

[ssDNA環(huán)化連接酶]
應(yīng)用ssDNA/RNA環(huán)化連接酶環(huán)化52nt的單鏈DNA分子后PAGE凝膠電泳，泳道1為未加環(huán)化酶，2為加入環(huán)化酶，3為環(huán)化產(chǎn)物加入ExoI酶消化產(chǎn)物。