一、實(shí)驗(yàn)方法介紹
基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）酪蛋白酶譜法（casein-zymography）電泳分析試劑是一種旨在通過酪蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在分離、蛋白復(fù)性、底物水解、染色等一系列步驟下，觀察并半定量深藍(lán)色背景中的白色清晰的基質(zhì)金屬蛋白酶條帶，根據(jù)分子量確定特異基質(zhì)金屬蛋白酶及其活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）、培養(yǎng)上清懸液、血清和關(guān)節(jié)滑液或腦脊液等基質(zhì)金屬蛋白酶－1，3，7 以及12等活性及其抑制劑的檢測。
二、實(shí)驗(yàn)技術(shù)背景
基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs 至少有28 種，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時(shí)參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞浸入轉(zhuǎn)移等。
根據(jù)降解的底物不同可將MMPs 分為4 大類：
（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13 主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；
（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；
（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；
（4）膜型金屬蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。
體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲(chǔ)備MMPs，當(dāng)需要MMPs 的信號(hào)傳遞到細(xì)胞后才臨時(shí)合成，合成的MMPs 以無活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細(xì)胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs 可激活另一種MMPs，形成瀑布效應(yīng)。酪蛋白酶譜法（casein-zymography）電泳分析技術(shù)使用β－酪蛋白作為酶的底物，具有簡便，無需抗體，同步觀察多種酶以及活化與否的優(yōu)勢。
三、嘉美實(shí)驗(yàn)酪蛋白酶譜法MMP3/10檢測實(shí)驗(yàn)服務(wù)介紹
實(shí)驗(yàn)采用酶譜法(zymography)檢測MMP-3、MMP-7、MMP-10活性，Zymography是一種基于SDS-PAGE電泳的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達(dá)1 nM (10~100 pg)，高于ELISA方法。通過制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer孵育，凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-3/10的大小位置(酶譜)及活性。
四、樣品準(zhǔn)備要求
1、血漿/血清/上清或體液樣品準(zhǔn)備：血漿或血清樣本加入1/10體積的檸檬酸鈉，1000rpm離心20分鐘，留取上清，以BCA法測定蛋白濃度，測定濃度以后，取約30ug蛋白上樣進(jìn)行電泳檢測。樣本準(zhǔn)備后可暫時(shí)4℃保存，不立即測定的樣品需-70℃保存，但不宜超過10天。
2、組織樣本準(zhǔn)備：取100mg新鮮組織以2ml勻漿液進(jìn)行勻漿（勻漿劑：0.1M Tris/ HCl/pH 7.4 ,0.5% TritonX-100，0.1mg/ml PMSF），12000g 4℃離心5分鐘，移取上清層至另一新的1ml離心管待測，取30ug蛋白上樣進(jìn)行電泳檢測。樣本準(zhǔn)備以后，樣品可暫時(shí)4℃保存，不立即測定的樣品需-70℃保存，但不宜超過10天。
3、細(xì)胞樣本準(zhǔn)備：取1個(gè)6孔板細(xì)胞（每孔細(xì)胞量約2×106個(gè)細(xì)胞），離心后以500ul勻漿液進(jìn)行超聲勻漿（勻漿劑：0.1M Tris/HCl/pH 7.4 ,0.5% TritonX-100，0.1mg/ml PMSF），12000g 4℃離心5分鐘，移取上清層至另一新的1ml離心管待測，取30ug蛋白上樣進(jìn)行電泳檢測。樣本準(zhǔn)備以后，樣品可暫時(shí)4℃保存，不立即測定的樣品需-70℃保存，但不宜超過10天。
五、實(shí)驗(yàn)須知
1、實(shí)驗(yàn)用試劑由實(shí)驗(yàn)室免費(fèi)提供；
2、檢測系統(tǒng)含陽性參照或內(nèi)參；
3、提供原始膠片；
4、實(shí)驗(yàn)委托方只需提供檢測樣品。