乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明書
分光光度法50管/24樣
注 意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒測定意義：
ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
測定原理：
ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無機磷，通過鉬酸銨定磷法測定無機磷的增加量來測定ACC活性。
需自備的儀器和用品：
分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：20mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑六：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑七：10μmol/mL 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
樣本的前處理：
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒測定步驟：
1、 分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 酶促反應試劑的配制和預熱：在試劑二瓶中加入6.5mL試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入5mL蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘。
3、定磷試劑的配制：按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑
應為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑七20倍稀釋，即取 0.5mL試劑七加9.5蒸餾水，充分混勻。
5、酶促反應
試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 |
試劑一 | 450 |
|
試劑二 |
| 250 |
試劑三 |
| 200 |
樣本 | 50 | 50 |
37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確反應30min后，90℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清
6、定磷
| 標準管 | 空白管 | 對照管 | 測定管 |
0.5μmol/mL標準磷應用液 | 100 |
|
|
|
蒸餾水 |
| 100 |
|
|
上清液 |
|
| 100 | 100 |
定磷試劑 | 900 | 900 | 900 | 900 |
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴30min，冷卻至室溫，在 660nm處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值A。標準管、空白管只要做一次即可，每個測定管需要設一個對照管。
注意：若測定管吸光值大于2，將樣品用提取液稀釋適當倍數(shù)后再進行測定，使吸光值小于2，可提高檢測靈敏度，計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。
ACC活性計算：
1、按組織蛋白濃度計算：
定義：每小時每毫克組織蛋白產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 ACC活力單位。
ACC (μmol/h/mg prot)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷
(V樣×Cpr)÷T=10×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計算：
定義：每小時每g組織產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 ACC活力單位。
ACC (μmol/h/g鮮重)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管）÷
(W× V樣÷V樣總)÷T=10×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W
3、 按細菌或細胞密度計算：
定義：每小時每500萬細菌或細胞產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 ACC活力單位。
ACC (μmol/h/104 cell)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管）÷
(500× V樣÷V樣總)÷T=0.02×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)
C標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，0.5小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
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