琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                        分光光度法 50管/48樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）試劑盒測(cè)定意義：

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

測(cè)定原理：

SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm處具有特征吸收峰，通過(guò)600nm吸光度的變化，測(cè)定2．6-DPIP的還原速度，代表SDH酶活性。

需自備的儀器和用品：可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體5mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加入2mL蒸餾水，用不完的試劑仍4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2mL蒸餾水，用不完的試劑4℃保存。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿600g，4℃離心5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的SDH（此步可選做）。

在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體SDH活性測(cè)定。

琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）試劑盒測(cè)定步驟和加樣表：

37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）保溫10min左右

用蒸餾水調(diào)零后，依次加各試劑到1 mL玻璃比色皿中，在加入試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，混勻，在600 nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和1分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

SDH活性的計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 SDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=1508×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=304.6×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.609×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。