α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性測定試劑盒說明書

                                 分光光度法50管/48樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性測定試劑盒測定意義：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物、植物微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。

測定原理：

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體55.5mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，4℃保存；

試劑七：粉劑×1支，4℃保存;

試劑八：粉劑×1支，4℃保存;

試劑九：粉劑×1支，-20℃保存;

試劑十：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2.1mL蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六、試劑七、試劑八和試劑九轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性測定試劑盒樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿600g，4℃離心5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體α-KGDH活性測定。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm處，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。

3、在1mL石英比色皿中依次加入40μL試劑十、60μL樣本和1.1mL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1和2min20s時的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

α-KGDH活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。