果膠裂解酶（pectinate lyases，PL）試劑盒說明書

分光光度法50管/24樣

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

果膠裂解酶（pectinate lyases，PL）試劑盒測定意義：

果膠裂解酶（EC4.2.2.10）是果膠酶的重要組成部分，是一種能降解植物細胞壁，導致植物組織軟化甚至死亡的解聚酶，來源比較廣泛，主要來源于微生物，可用于果汁、果酒的澄清，提高水果出汁率，植物病毒的純化，紙漿的漂白和紡織品的生物精煉，在減少環(huán)境污染和降低能源消耗方面具有潛在的應用價值。

測定原理：

果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵，生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸，在235nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取：

1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2．細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 培養(yǎng)液：直接測定。

果膠裂解酶（pectinate lyases，PL）試劑盒測定操作表：

酶活性計算公式：

1. 組織中PL活性

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min/mg prot）= A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 64.1×A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min/g 鮮重）= A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 64.1×A÷W

2. 細胞PL活性

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每10⁴個細胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min/10⁴cell）= A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T 

    = 64.1×A÷細胞數(shù)量

3. 培養(yǎng)液PL活性

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min/mL）= A÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

= 64.1×A

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)：5200L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，1mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min