NAD-蘋果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）試劑盒說明書
分光光度法 50管/48樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
NAD-蘋果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）試劑盒測(cè)定意義：
ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物ME活性測(cè)定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測(cè)定原理：
NAD-ME催化NAD+還原成NADH，在340nm下測(cè)定NADH增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存。；
試劑一：液體40mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1支，4℃保存；用時(shí)加2mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；用時(shí)加1mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
NAD-蘋果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）試劑盒測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑一、二、三和四置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。如果一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
3、 操作表：
試劑名稱（μL） | 測(cè)定管 |
試劑一 | 600 |
試劑二 | 225 |
試劑三 | 30 |
試劑四 | 15 |
樣本 | 30 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻，立即記錄 340 nm波長(zhǎng)下初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意：如果ΔA＜0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到2分鐘或5分鐘。
NAD-ME活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 4823×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =9.646×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，9×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
關(guān)鍵字： NAD-蘋果酸酶（Malic enzym;NAD-蘋果酸酶（Malic enzym;
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